苏州大学苏州医学院附属第一医院、苏州大学苏州医学院生物与医学研究所的谢峰教授在Nature（IF：50.5）杂志发表文章“Targeting FOXM1 condensates reduces breast tumour growth and metastasis”。团队发现相分离（LLPS）在生物学过程中具有重要作用，但其结构识别和功能调控仍面临挑战。FOXM1（叉头盒蛋白M1）作为一种致癌转录因子，通过LLPS维持染色质可及性和超增强子功能，支持肿瘤转移。该研究揭示了FOXM1通过LLPS调控肿瘤转录和超增强子的分子机制，并开发了以IDR为靶点的肽类药物。AMPK激动剂和针对IDR的肽为肿瘤免疫治疗提供了新型干预策略，具有显著的临床应用潜力。
相分离（LLPS）在细胞内为生化反应提供了一种动态的调控机制，近年来被证明在健康和疾病中扮演重要角色。然而，哪些蛋白质在肿瘤细胞中经历LLPS并在肿瘤生长和转移中起决定性作用尚不明确。FOXM1被鉴定为一种具有相分离特性的癌蛋白，其通过与FKH-DNA的结合支持染色质重塑和肿瘤转移相关基因的表达。研究发现，AMPK可以通过对FOXM1内在无序区（IDR1）进行磷酸化，破坏FOXM1冷凝物的形成，从而显著降低其转录活性。这一磷酸化机制引起的静电排斥为靶向FOXM1的LLPS特性提供了新的调控方式，也为肿瘤治疗开辟了新的方向。基于上述发现，研究团队设计了拟磷肽FIP4，作为特异性破坏FOXM1 LLPS的工具，并将其装载于纳米颗粒（FIP4-NPs）中进行验证。FIP4-NPs能够显著抑制肿瘤生长和转移，同时增强肿瘤的免疫原性，改善抗肿瘤免疫治疗效果。该研究首次系统地揭示了FOXM1的LLPS特性及其在肿瘤中的关键功能，为靶向相分离蛋白提供了可行性，并通过开发FIP4展示了精准靶向FOXM1 LLPS的临床应用潜力。这一创新性策略不仅扩展了难靶向蛋白的药物开发路径，也为癌症治疗提供了重要的新手段。
研究通过筛选发现FOXM1是乳腺癌细胞中关键的相分离相关蛋白，其通过内在无序区域（IDR1）介导液-液相分离（LLPS），形成核内凝聚体。这些凝聚体在高蛋白浓度、弱碱性和高温条件下更易形成，且依赖弱疏水相互作用，可被热、蛋白酶K或1,6-己二醇破坏。实验表明，删除IDR1会完全阻止FOXM1的LLPS，且单独的IDR1能够形成液滴，说明IDR1是其LLPS的必要条件。LLPS状态的FOXM1通过与DNA结合显著增强其转录活性，特别是在靶基因（如CDC25B和CCNA2）表达方面。此外，FOXM1的LLPS还导致纤维状淀粉样聚集体的形成，这种聚集体可能进一步增强其功能。研究揭示了FOXM1通过IDR1介导的LLPS是其发挥转录和促癌功能的关键，为以相分离为靶点的抗肿瘤治疗提供了重要理论支持。
（2）AMPK通过S376磷酸化调控FOXM1的LLPS
为了研究FOXM1 LLPS的决定因素，研究使用了268种表观遗传化合物，发现AMPK激活剂（如二甲双胍、AICAR等）能够抑制FOXM1在细胞核内的LLPS，减少其靶基因的转录活性。AMPK通过磷酸化FOXM1的S376位点介导这一作用。质谱分析确定S376是AMPK磷酸化的关键位点，磷酸化引发静电排斥效应，从而破坏FOXM1的LLPS能力。实验显示，AMPK激活或S376磷酸化模拟突变（S376E和S376D）均显著减少FOXM1液滴的形成、DNA结合能力及转录活性。而未磷酸化FOXM1仍能维持这些功能。通过遗传工具生成的完全磷酸化FOXM1（p-FOXM1(S376)）几乎无法形成液滴或与DNA相互作用。研究表明，AMPK介导的S376磷酸化是调控FOXM1 LLPS和转录活性的关键机制，为以AMPK激活剂为基础的抗肿瘤治疗提供了理论支持。研究生成了敲除FOXM1的MDA-MB-231细胞，稳态表达野生型FOXM1、FOXM1(S376A)和FOXM1(S376E)。实验结果显示，与野生型FOXM1相比，FOXM1(S376E)突变显著降低了细胞增殖和肿瘤形成能力，而FOXM1(S376A)突变未见显著影响。在裸鼠模型中，FOXM1(S376E)细胞形成的肿瘤更小，二甲双胍诱导的AMPK激活显著抑制野生型FOXM1细胞的肿瘤生长，但对FOXM1(S376A)细胞无效。进一步验证中，4T1细胞的实验结果与上述一致，FOXM1(S376E)抑制肿瘤生长和肺转移的能力显著强于FOXM1(S376A)。临床样本分析表明，AMPK激活指标p-AMPKα(T172)与p-FOXM1(S376)在乳腺癌组织中表达下调，且表达水平与肿瘤分期呈负相关。总结来看，FOXM1(S376)磷酸化是AMPK抑制肿瘤生长的重要介质，通过破坏FOXM1的LLPS状态阻断致癌转录，从而实现肿瘤的抑制作用。这为以AMPK为靶点的肿瘤治疗提供了重要线索和支持。
研究表明，FOXM1(S376E)突变显著降低了染色质的可及性和超级增强子的活性。ATAC-seq和CUT&Tag分析发现，相较于亲本细胞，S376E敲入细胞中FOXM1的启动子结合减少，H3K27ac与染色质的关联也普遍降低，特别是在超级增强子驱动的肿瘤转移相关基因上。转录谱显示，超级增强子依赖基因的表达在S376E细胞中显著下调，而与典型增强子相关的基因表达变化较小。此外，FOXM1(S376E)突变显著减少了FOXM1对致癌基因（如KRAS、MYC）的调控能力，但增强了其对免疫原性相关基因（如MAGE-B、IFNB1）的结合与表达。机制研究发现，S376E突变导致细胞内DNA双链断裂显著增加，未修复的双链DNA通过cGS-STING途径激活先天免疫反应，促进干扰素和免疫刺激基因的表达。整体上，S376磷酸化的FOXM1在很大程度上丧失了驱动致癌基因表达的能力，却获得了适度调控免疫原性基因的能力，为增强肿瘤免疫治疗效果提供了新的策略和方向。（5）s376磷酸化的FIP4降低FOXM1 LLPS为了干扰FOXM1的LLPS，研究设计了FOXM1干扰肽(FIPs)，其中FIP4通过模仿IDR1 C末端区域，结合到FOXM1的IDR1区域，并通过引入S376磷酸基团的静电排斥力最有效地破坏FOXM1的LLPS。FIP4能够抑制FOXM1的多价结合，使其聚集体解聚为单体，并阻断FOXM1与FKH-DNA的结合和融合。相比于其他设计的肽（如FIP3），FIP4在抑制FOXM1自结合和LLPS方面表现出更高的效率。在细胞实验中，FIP4显著减少了FOXM1的核凝聚体形成，并抑制其靶基因的转录活性，降低了肿瘤细胞的增殖、迁移和球形形成能力。RNA测序分析显示，FIP4处理不仅抑制了与肿瘤侵袭和转移相关的致癌转录，还显著增强了癌症抗原和干扰素刺激基因（ISGs）的表达，从而提高了肿瘤细胞的免疫原性。总体而言，FIP4通过拮抗FOXM1的LLPS，有效抑制了肿瘤细胞的恶性行为，同时增强了肿瘤的免疫原性，为以FOXM1 LLPS为靶点的抗肿瘤治疗提供了有力支持。
研究表明，FIP4能够显著抑制裸鼠模型中的肿瘤生长和转移。在静脉注射荧光素酶标记的4T1细胞模型中，FIP4处理显著减少肺部转移的大小、数量和面积。在自发肿瘤模型（MMTV-PyMT小鼠）中，FIP4延迟了肿瘤发作，抑制了原发肿瘤的生长，并降低了肺转移发生率和转移结节数量。这表明，FIP4在抑制肿瘤生长和转移方面具有显著作用。
为了提高FIP4的肿瘤靶向性，研究开发了pH敏感且含有RGD修饰的纳米颗粒（FIP4-NPs），能够在肿瘤部位有效释放FIP4。与游离FIP4相比，FIP4-NPs显著增强了FIP4在肿瘤部位的积累，改善了肿瘤免疫原性并抑制了肿瘤恶性基因的表达特征。联合FIP4-NPs与抗PD1免疫疗法进一步显示出协同效果，显著降低肿瘤生长和转移，并增加肿瘤浸润的CD8+ T细胞及颗粒酶B的产生。结论：通过RGD-FIP4-NPs靶向拮抗FOXM1的LLPS，能够抑制肿瘤进展并显著改善抗PD1免疫治疗效果。这种联合疗法为乳腺癌治疗提供了全新策略和潜在应用方向。•液-液相分离（LLPS）是理解无膜细胞器划分细胞活动的核心机制。在本研究中，FOXM1被发现是乳腺肿瘤细胞中通过LLPS划分转录装置和维持全基因组染色质可及性及基因转录的关键蛋白。通过定义FOXM1为AMPK的底物，研究开发了AMPK磷酸化肽（如FIP4），能够破坏FOXM1凝聚体，阻止其致癌转录功能，并显著重建肿瘤的免疫原性。
•研究还揭示了FOXM1通过自结合、寡聚及相分离的机制实现其功能的调控，并阐明了AMPK磷酸化在FOXM1功能开关中的核心作用。AMPK的激活与FOXM1 LLPS的破坏直接关联，提供了增强肿瘤免疫原性的新途径。
•本研究不仅为识别和靶向相分离蛋白提供了新方法，还建立了FOXM1在肿瘤生长和免疫调节中的功能模型，具有重要的基础研究意义和临床应用潜力，为未来抗肿瘤治疗开辟了新方向。
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