今天给大家分享一篇文献，《Generation of Recombinant Rotaviruses Expressing Fluorescent Proteins by Using an Optimized Reverse Genetics System》。该研究通过优化转染的质粒比例提高了轮状病毒（Rotavirus）的反向遗传拯救效率。
轮状病毒基因组由11股双链RNA（dsRNA）组成，共编码12种蛋白质，6种结构蛋白，分别为VP1、VP2、VP3、VP4、VP6和VP7；6种非结构蛋白，分别为NSP1、NSP2、NSP3、NSP4、NSP5和NSP6。
首先，作者在以往研究的基础上，将11段病毒基因组均以0.75ug转染细胞作为对照组，然后分别将不同的基因组片段提高3倍转染量（2.25ug），发现提高NSP2或NSP5基因的转染量，能够显著提高轮状病毒的拯救效率。其内在机制可能是NSP2和NSP5之间能够相互作用，促进病毒工厂的形成，提高病毒的复制和组装效率。
需要注意的是，11个基因组片段均以1:1的比例转染时，有时并不能拯救出病毒。
通过调整转染的质粒比例提高轮状病毒拯救效率（Satoshi Komoto et al. 2018. J Virol）
11质粒系统拯救轮状病毒策略示意图（Satoshi Komoto et al. 2018. J Virol）
之后，作者用电镜检查了转染11个轮状病毒cDNA质粒的细胞中的病毒粒子，发现当11个质粒均为1:1转染时，大约8.9%的细胞含有轮状病毒样颗粒，而将NSP2和NSP5的转染量增加3倍时，则有约22.7%的转染细胞中含有轮状病毒样颗粒。
转染轮状病毒感染性克隆cDNA后的电镜结果（Satoshi Komoto et al. 2018. J Virol）
然后，作者在NSP1基因中插入了2A肽-Nluc基因，拯救了表达荧光素酶的重组轮状病毒rSA11-Nluc。将拯救的rSA11-Nluc感染MA104细胞，12小时即可检测到荧光素酶的表达，之后持续升高。生长曲线结果表明，rSA11-Nluc的复制能力低于亲本毒rSA11-L2。
并且，rSA11-Nluc在CV-1细胞中形成的空斑也显著小于亲本毒rSA11-L2。
以上结果说明，用2A肽-Nluc基因取代NSP1基因的N端能降低轮状病毒的复制。
表达纳米荧光素酶的重组轮状病毒rSA11-Nluc拯救（Satoshi Komoto et al. 2018. J Virol）
然后，作者将Nluc基因替换成EGFP或mCherry，拯救了表达EGFP或mCherry的重组轮状病毒rSA11-EGFP或rSA11-mCherry。
表达EGFP或mCherry的重组轮状病毒rSA11-EGFP或rSA11-mCherry拯救（Satoshi Komoto et al. 2018. J Virol）
类似的，rSA11-EGFP或rSA11-mCherry在MA104细胞中的复制能力低于亲本毒rSA11-L2。rSA11-EGFP或rSA11-mCherry在CV-1细胞中形成的空斑也显著小于亲本毒rSA11-L2。
重组轮状病毒rSA11-EGFP和rSA11-mCherry的感染性比较（Satoshi Komoto et al. 2018. J Virol）
嘴后，为了验证rSA11-EGFP和rSA11-mCherry的复制能力降低是由于缺少全长NSP1蛋白表达引起的，作者通过过表达发现回补NSP1能够恢复rSA11-EGFP和rSA11-mCherry的复制能力。
总之，这篇文章报告了一种高效且简单的仅转染表达11个基因片段的11个cDNA质粒的反向遗传学系统来拯救重组轮状病毒。利用该系统，作者设计了携带荧光素酶（Nluc）和荧光报告基因（EGFP和mCherry）的感染性轮状病毒。这些携带报告基因的重组病毒在研究期间保持遗传稳定。这种高效的反向遗传学表达报告基因的系统和重组轮状病毒将是用于研究轮状病毒分子生物学和开发下一代疫苗的试剂盒和表达载体的重要工具。
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