大家好，今天给大家分享一篇文献《An infectious West Nile Virus that expresses a GFP reporter gene》。
西尼罗河病毒（West Nile Virus，WNV）是一种由蚊子传播的嗜神经性黄病毒，可引起人类和动物脑炎。自1999年被引入西半球以来，西尼罗河病毒在北美迅速传播，将这种病毒确定为一种重要的新兴病原体。在这项研究中，作者开发了一种编码GFP报告基因的DNA驱动的西尼罗河病毒感染性分子克隆的克隆和病毒拯救。
首先，作者在WNV II系感染性cDNA克隆（命名为SP6WN/Xba）的基础上，将SP6启动子替换为CMV启动子，并且引入HDV核酶从而产生精确地基因组3'末端。同时，作者在NS5基因后插入了Not1限制性酶切位点，将该质粒命名为pWNII-Not。
为了引入GFP报告基因，作者在Not1酶切位点处插入EMCV的IRES核糖体进入位点，通过IRES来启动GFP的表达，将该质粒命名为pWNII-GFP。
WNII-GFP 报告病毒示意图（Theodore C Pierson et al. 2005. Virology）
将pWNII-Not或pWNII-GFP质粒转染HEK 293T细胞能够产生感染性WNV病毒粒子。pWNII-Not质粒转染24小时的细胞上清中病毒滴度可达到10的6次方pfu/mL，之后继续升高。并且CMV启动子和3'UTR中Not1酶切位点的引入并不会对拯救效率产生影响。而WNIIGFP转染细胞的上清中病毒滴度在早期更低，但在转染后72小时也能够达到10的6次方pfu/mL。
之后，作者比较了WNII-Not和WNIIGFP在BHK21细胞中的生长曲线，发现WNIIGFP的滴度降低10-20倍，这可能是由于插入长达1.3kb的IRES-GFP导致的。
WNII-GFP报告病毒的感染滴度（Theodore C Pierson et al. 2005. Virology）
然后，作者用流式检测了WNIIGFP转染的HEK 392T细胞中GFP的表达，发现阳性率可达95.46%。类似的，WNIIGFP感染BHK21细胞中GFP阳性率可达95.55%。同样，作者也用免疫荧光检测了WNIIGFP感染HeLa时GFP的表达。
西尼罗河病毒基因组中GFP的表达（Theodore C Pierson et al. 2005. Virology）
由于WNV基因组长达1.1万bp，而插入GFP之后则长达1.3万bp，因此作者检测了WNII-GFP基因组的稳定性。作者在HEK 293T细胞中拯救病毒，并在HEK 293T细胞中传代4次，每次传代感染48小时，即病毒复制了8轮。
每次传代后都用流式检测GFP和MWV E蛋白的表达。结果发现E蛋白能过稳定表达，而GFP表达随着传代逐渐降低。然后作者通过RT-PCR检测了WNII-GFP传代之后的基因组大小，发现传代之后的WNII-GFP基因组减小，说明GFP报告基因可能被删除。也就是说，WNV基因组能够容纳外源基因的插入，但在选择压力下报告基因可能被删除。
WNII-GFP体外稳定性（Theodore C Pierson et al. 2005. Virology）
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