今天给大家分享一篇文献«Construction and characterization of an infectious clone of coxsackievirus A16»。文献报告了CVA16感染性cDNA克隆的构建和表征。这种感染性克隆的可用性将大大加强未来的病毒学研究和用于CVA16疫苗的开发。
柯萨奇病毒CVA16毒株shzh05-1（GenBank：EU262658）含有7410 个核苷酸。作者提取病毒RNA并使用oligo（dT）引物进行反转录。
将CVA16基因组分为3段扩增，第1段为1-4392bp，第2段为4381-7410bp，第3段为6087-7410-polyA。将第1段和第2段通过Xba1酶切位点连接得到pcDNA3.1-CV(1-7410)。再将第3段替换pcDNA3.1-CV(1-7410)中的相应片段最终得到pcDNA3.1-CV(1-7410-pA)。
最后扩增T7启动子和CVA(1-7410-pA)一起插入pMD19-T载体，得到pMD19-CV。
全长CVA16感染性克隆构建示意图（Liu et al. Virology Journal 2011, 8:534）
用Not1线性化后，经T7 RNA聚合酶体外转录得到CVA16 RNA，用琼脂糖凝胶电泳检测体外转录获得的CVA16 RNA是否成功。
琼脂糖凝胶电泳检测体外转录获得的CVA16 RNA（Liu et al. Virology Journal 2011, 8:534）
将体外转录获得的CVA16 RNA转染RD细胞，72小时后收集细胞检测检测了VP1蛋白表达和病毒负链RNA的表达。
WB检测VP1蛋白表达（Liu et al. Virology Journal 2011, 8:534）
RT-PCR检测CVA16 RNA转染细胞中病毒负链基因组的表达（Liu et al. Virology Journal 2011, 8:534）
随后，作者检测了野生型CVA16感染RD细胞（下图B）、CVA16 RNA转染RD细胞（下图C）和CVA16感染性克隆拯救病毒感染RD细胞（下图D）形成的CPE。
RD细胞感染后形态（Liu et al. Virology Journal 2011, 8:534）
接着，作者分别用VP0、VP1和VP4抗体检测了第一代拯救病毒，第二代拯救病毒和野生型病毒感染细胞后VP0、VP1和VP3的蛋白表达，发现没有差异，说明拯救的病毒和野生型病毒在蛋白表达和加工过程中没有差异。
VP0、VP1和VP3抗体检测蛋白表达（Liu et al. Virology Journal 2011, 8:534）
同样的，野生型CVA16和拯救的CVA16感染vero细胞时的蚀斑大小也一致。
野生型CVA16和拯救的CVA16感染vero细胞蚀斑（Liu et al. Virology Journal 2011, 8:534）
这项研究报告了CVA16新型感染性cDNA克隆的构建和表征。该cDNA克隆能够产生感染性CVA16病毒，该病毒在遗传学和生物学上与野生型病毒相同。CVA16感染性克隆的构建将极大地促进对其毒力的遗传决定因素的研究。该克隆还将允许快速、合理地开发和测试针对CVA16的候选减毒活疫苗和抗病毒疗法。
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