大家好，今天给大家分享一篇文献《Rescue of the 1947 Zika Virus Prototype Strain with a Cytomegalovirus Promoter-Driven cDNA Clone》。
这篇文献报告了携带巨细胞病毒启动子（CMV）的1947年乌干达 MR766 寨卡病毒（ZIKV）的感染性cDNA克隆质粒的构建 ，并可直接转染该质粒至哺乳动物细胞中拯救感染性寨卡病毒。作者在ZIKV的非结构蛋白1 （NS1）区域中掺入合成内含子，从而降低细菌中病毒序列的毒性。
转染携带野生型MR766 ZIKV基因组的质粒后能够产生高水平的感染性病毒。多步生长曲线和空斑实验表明，质粒转染产生的MR766病毒表现出与其亲本分离株的生长特征比先前发表的2010年柬埔寨分离株和2015年巴西分离株的cDNA拯救的ZIKV更相似。该ZIKV感染性克隆将有助于研究ZIKV感染和发病机制的遗传决定因素，并且应该适合构建表达报告蛋白并代表一系列ZIKV分离株的多种感染性克隆。
众所周知，黄病毒序列很难在细菌中增殖，这可能是因为隐秘细菌启动子的存在允许病毒蛋白的表达导致细菌毒性。
目前有多种策略来限制和预防细菌死亡，包括（1）使用对这种毒性更具抵抗力的细菌、（2）拷贝数极低的质粒，从而减少病毒翻译产物的产生，以及（3）使用可扩增质粒的酵母等替代生物。（4）另一种策略是将病毒基因组分离成多个质粒，其中每个质粒都可以通过限制性内切酶消化切除并连接从而获得适合体外转录的全长病毒cDNA。（5）最后则是同本文报道的一样，在黄病毒NS1基因中插入合成内含子来抑制毒性蛋白在细菌中的表达。
首先作者将纯化的寨卡病毒MR766株的RNA进行反转录，然后插入高拷贝的pCDNA6.2质粒中，置于CMV启动子和HDVr以及SV40 polyA信号之间。为了避免病毒蛋白在细菌中的翻译导致毒性，作者在NS1基因内部插入了合成了内含子。同时，作者将NS5（RdRp）的催化活性位点中的GDD突变为GNN，命名为Pol(-)，从而病毒丧失复制能力，以此作为阴性对照。
寨卡病毒基因组和感染性cDNA克隆质粒示意图（Megan C Schwarz et al. 2016. mSphere）
将上述构建的野生型或Pol(-) MR766 ZIKV感染性cDNA克隆质粒转染293T细胞，免疫荧光检测到ZIKV的E蛋白和NS3蛋白表达，并且野生型比Pol(-)组表达更多的E和NS3，因为Pol(-)的病毒无法复制和传播。通过流式和WB实验同样也得到了类似的结果。
野生型或Pol（-） MR766 ZIKV质粒转染的细胞表征（Megan C Schwarz et al. 2016. mSphere）
因为作者在NS1基因内部插入了内含子，所以NS3蛋白的表达需要在RNA水平上切除内含子序列，因此作者通过RT-PCR检测了NS1的RNA剪切情况，发现wt组的NS1大小和亲本毒一致，而Pol（-）的NS1存在两条带，说明Pol（-）病毒既存在剪切的NS1，也存在未剪切的NS1。
同样，测序结果也显示，wt质粒转染拯救的病毒切除了内含子序列，而Pol（-）病毒部分切除了内含子，部分未切除内含子。
验证野生型或Pol（-）MR766 ZIKV质粒转染的细胞中的内含子RNA剪切（Megan C Schwarz et al. 2016. mSphere）
最后，为了验证拯救的病毒具有感染性，作者将wild-type或Pol(-) 转染的293T细胞上清感染vero细胞，通过免疫荧光检测E蛋白和NS3蛋白表达。
通过对质粒拯救的病毒和亲本毒的生长特性进行比较发现，拯救的病毒形成的空斑比亲本毒小约1.35倍，但二者的复制能力没有显著差异。
从野生型或 Pol（-） MR766 ZIKV 质粒中拯救的病毒与亲本MR766病毒比较（Megan C Schwarz et al. 2016. mSphere）
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