1981年,V R Racaniello和D Baltimore和Science期刊上发文,建立了人类历史上首个RNA病毒反向遗传学系统,即脊髓灰质炎病毒(poliovirus)的反向遗传学。在该文中,作者建立并比较了poliovirus的cDNA质粒拯救法和poliovirus基因组RNA拯救法的效率。
简言之,作者将poliovirus的全基因组cDNA插入pBR322载体中,转染CV-1细胞或HeLa细胞,可以成功拯救出高滴度的poliovirus。并且,poliovirus基因组的前115个碱基对其感染性是必需的。
该文是首次发现单股正链RNA病毒的基因组cDNA在哺乳动物细胞上具有感染性,能够通过转染cDNA拯救RNA病毒。
具体的质粒构建方法如下,由于当时基因克隆技术的落后,整个构建步骤比较多,目前已不具参考性。
作者在10cm dish的CV-1细胞或HeLa细胞中转染10ug的poliovirus的cDNA(pVR106质粒),或2ug的poliovirus的基因组RNA,比较了两种方法拯救病毒的效率。
pVR106质粒被Hinf1酶切破坏完整性后不能拯救出病毒。pVR104质粒缺失了poliovirus基因组的前115个碱基,不能拯救出病毒,说明poliovirus基因组的前115个碱基对其感染性是必需的。pBR322质粒空载不能拯救出病毒。病毒RNA经核糖核酸酶消化后不能拯救出病毒。
CV-1细胞的拯救效率高于HeLa细胞。
poliovirus全基因组cDNA质粒拯救效率和病毒RNA拯救效率类似。
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