今天给大家分享文献《RNA polymerase I-driven reverse genetics system for enterovirus 71 and its implications for vaccine production》
EV71是手足口病（HFMD）的病原体，最常见于婴儿和6岁以下儿童。EV71 感染通常较轻，但偶尔会导致从无菌性脑膜炎到急性弛缓的神经系统症状，从而引起瘫痪和致死性脑干脑炎。
这项研究建立了一种简化的反向遗传学方法，可以在短短10天内从具有详细遗传信息的不同临床分离株中反向遗传拯救EV71病毒。该方法可以加速EV71疫苗的开发。
作者用EV71-Uni-F和EV71-Uni-R引物通过RT-PCR扩增了不同的EV71毒株亚群(A, B2, B4, B5,C1, C2, C4 or C5) ，通过融合PCR将EV71全基因组克隆到pJET-hPol1/mTer载体中。
该EV71感染性克隆5'端含有hPol1（人RNA聚合酶1）启动子，3'端含有mTer（鼠终止子）。
直接将EV71感染性克隆转染Vero细胞即可拯救出病毒。虽然pJET-hPolI/mTer-EV71-B5质粒转染后不出现CPE，但拯救的P1代病毒感染vero细胞则可以产生CPE。
RNA聚合酶Ⅰ系统拯救EV71（Tao Meng et al. 2012. Virol J）
转染1ug的不同pJET-hPolI/mTer-EV71感染性克隆质粒至vero细胞3天后均可以产生10^3 TICD50的病毒。然后将拯救的病毒在vero细胞中传代2代后，滴度均可以达到约10^3 TICD50/mL。
然后作者将拯救的不同EV71毒株在vero细胞中传代5代后，测定一步生长曲线，发现拯救的EV71-B5病毒和野生型病毒具有相同的生长特性，病毒滴度在感染后第5天达到高峰。
EV71-B5拯救病毒和野生型病毒比较（Tao Meng et al. 2012. Virol J）
总之，该论文通过一对通用引物RT-PCR扩增EV71全基因组然后将其插入含有hPol1启动子的反向遗传学质粒中，以快速生产感染性 EV71 种子原液。整个过程只用了10天。此外，在小鼠中，拯救的病毒保留了与野生型病毒相同的免疫原性。该反向遗传学系统大大简化了EV71候选疫苗的分离和选择，并可加速EV71疫苗的开发。
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