今天给大家分享一篇文献《PCR-based reverse genetics strategy for bluetongue virus recovery》，该研究报道了一种基于PCR的蓝舌病毒反向遗传学拯救策略。
蓝舌病毒（Bluetongue virus，BTV） 是一种新兴的昆虫媒介传播的病原体，主要感染野生反刍动物和牲畜，其基因组由10个线性的双链RNA片段组成。BTV对世界许多地方的农业经济具有严重的影响。目前拯救BTV的反向遗传学策略主要依赖于从病毒基因组片段的cDNA经体外合成RNA，并且需要借助辅助质粒的参与。RNA合成是一项艰巨的工作，而且更加复杂需要昂贵的试剂和细致的操作程序。此外，还必须将靶基因克隆到特定的载体中，以制备用于RNA转录的模板。
该研究建立了一种便捷的基于PCR的BTV反向遗传学平台，该策略可有效替代原有的BTV抢救方法。此外，这种反向遗传学策略还可能适用于其他的Orbiviruses。
首先作者将BTV-1（SZ97/1株）的VP1、VP3、VP4、VP6、VP7、NS1和NS2插入pCI-neo载体，从而构建了7个辅助质粒。
随后作者通过PCR扩增了BTV-1的10个基因组片段，并在5'端引入T7启动子。G为转录起始位点，3'端不含额外的碱基，从而保证RNA转录本和病毒原始序列一致。
PCR扩增示意图（Qingyuan Xu et al. 2019. Virol J）
作者通过2步转染法拯救BTV。首先分别转染700ng、600ng、500ng、300ng、300ng、500ng和300ng的7个辅助质粒至BSR细胞中。转染后约20小时，再将10个BTV的基因组片段转染BSR细胞（400ng片段1、300ng片段2、300ng片段3、200ng片段4、200ng片段5、200ng片段6、100ng片段7、100ng片段8、100ng片段9和100ng片段10），直到细胞出现CPE。
同样，作者也通过该方法将BTV-1（SZ97/1株）的片段2替换为BTV2IT(L)的片段2，拯救了重配病毒，命名为BTV-1seg2。
基于PCR的反向遗传学示意图（Qingyuan Xu et al. 2019. Virol J）
将收获的重组病毒感染BHK21细胞，通过IFA验证病毒拯救成功。
IFA验证感染性BTV-1（SZ97/1株）的产生（Qingyuan Xu et al. 2019. Virol J）
最后，足总和通过PCR验证了BTV-1seg2重配病毒，并且比较了野生型wtBTV-1、重组rBTV-1和BTV-1seg2的生长特性，发现rBTV-1和wtBTV-1具有相似的复制速度。而BTV-1seg2在开始的48小时复制速度显著慢于wtBTV-1和rBTV-1，但最终三者可以达到相似的滴度。
野生型病毒和重组病毒在BHK21细胞中的生长曲线（Qingyuan Xu et al. 2019. Virol J）
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