大家好，今天给大家分享一篇文献《Construction of a novel porcine circovirus type 2 infectious clone as a basis for the development of a PCV2 iDNA vaccine》
猪圆环病毒（PCV）相关疾病是一种传染性很强的疾病，具有重大的经济后果。该病在许多国家和地区流行。为了生成PCV2的遗传标记毒株，通过应用iDNA感染性克隆技术，将Sal I限制性内切酶位点插入PCV2感染新性克隆中作为遗传标记。iDNA 代表编码全长DNA的质粒，PCV2 的基因组组装在基于 pcDNA3.1 的载体中。通过将感染性克隆转染到PK-15细胞中来拯救突变体PCV2，并通过免疫过氧化物酶单层测定（IPMA）进行验证。病毒基因组可以通过PCR和限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）与野生型亲本区分开来。昆明小鼠通过鼻内和腹膜内途径接种PCV2感染性克隆或拯救的病毒。在接种后7天时，来自两个接种组的大多数小鼠血清中出现 PCV2 特异性抗体，并且特异性抗体水平稳定至少42天。并且在两个接种组的大多数猪中检测到病毒血症，病毒血症从感染后7天开始开始，持续4周。动物实验表明，PCV2感染性克隆和拯救的病毒都可以在小鼠体内复制并诱导小鼠产生抗PCV2抗体。PCV2的感染性克隆将有助于进一步研究通过反向遗传学技术研究一种潜在的减毒iDNA疫苗。
首先，作者将PCV2基因组的用F1和R1引物进行PCR，产物经过Sal1酶切后插入pMD 19-T载体中。然后再用F2和R2进行扩增，插入pcDNA3.1(+)载体得到 pcDNA3.1(+)-PCV2。
感染性DNA克隆质粒pcDNA3.1（+）-PCV2的构建（Wei-Cheng Wang et al. 2015. J Virol Methods）
用Hind III和BamH I 对pcDNA3.1(+)-PCV2质粒进行酶切，得到5.4kb和1.8kb的片段。
用Hind III 和 BamH I 消化鉴定含有 PCV2 基因组的重组质粒（Wei-Cheng Wang et al. 2015. J Virol Methods）
将pcDNA3.1(+)-PCV2感染性克隆质粒转染PK15细胞，用PCV-2抗血清进行染色，PCV2感染的细胞呈现红棕色（下图A），对照为下图B。
通过IPMA检测感染标志物毒株的PK-15细胞中的PCV2抗原（Wei-Cheng Wang et al. 2015. J Virol Methods）
然后，作者通过PCR-RFLP方法来区分遗传标记的病毒和野毒。含有遗传标记的病毒经Sal 1消化后能够产生1332bp和435bp的两个片段，而野毒不能被Sal 1消化。
PCR-RFLP法区分PCV2遗传标记株与野生型病毒（Wei-Cheng Wang et al. 2015. J Virol Methods）
最后，作者用ELISA检测了抗PCV特异性抗体水平，发现P-PCV2和W-PCV2感染一周后产生抗PCV特异性抗体，并且能稳定存在至少42天，之后抗体滴度逐渐升高。
鉴定P-PCV2、W-PCV2、pCDNA3.1、MEM 的 PCV2 特异性抗体（Wei-Cheng Wang et al. 2015. J Virol Methods）
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