今天给大家分享一篇文献《Rescue of mumps virus from cDNA》，该研究报道了从感染性cDNA克隆中拯救腮腺炎病毒 （mumps virus，MUV）的方法。
1935年，Johnson 和 Goodpasture 首次证明流行性腮腺炎的病原体是一种可以复制的病毒。从那时起，组织培养物中的增殖促进了病毒的分类和流行性腮腺炎病毒 （mumps virus，MUV） 生物学特性的研究。
根据核衣壳形态、基因组结构和蛋白质的生物学特性，流行性腮腺炎病毒被归类为副粘病毒科、副粘病毒亚科、鲁布拉病毒属。
腮腺炎病毒基因组为单股负链RNA，基因组RNA不具感染性。因此从cDNA中拯救腮腺炎病毒至少需要病毒NP、P和L蛋白，以及全长正义基因组RNA 转录本。
为了辅助验证从cDNA克隆中拯救腮腺炎病毒的有效性，作者先构建了腮腺炎病毒的微基因组CAT基因报告系统。具体的是将3’ MUV leader (55 nt)+90 nt的NP基因UTR、CAT报告基因和137 nt的L基因UTR+5’ MUV trailer (24 nt)置于T7启动子和T7终止子之间。
需要注意的是，T7启动子需要去除末端的3个G，为了使总碱基数为6的倍数，从而遵循“6碱基规则”。同样的，需要在T7启动子和MUV 3'端之间插入HDV核酶，从而产生精确的3'端，也是为了保证总总碱基数为6的倍数。
将MUV-CAT微基因组报告质粒经体外转录产生的RNA转染经MUV预先感染的293T细胞能够产生CAT信号，但效率较低。而MUV-CAT微基因组RNA和MUV的NP、P、L基因共转染则能够显著提高CAT报告基因的表达。并且，CAT报告基因的拯救效率在A549细胞中最高，其次是HEP2和293T细胞。
MUVCAT微基因组构建示意图（D K Clarke et al. 2000. J Virol）
为了拯救MUV活毒，作者将MUV全基因组置于T7启动子和T7终止子之间，并且在Trailer后插入HDV核酶。将MUV全基因组RNA和NP、P及L基因共转染A549细胞能够成功拯救出MUV。
MUV全长感染性cDNA克隆构建示意图（D K Clarke et al. 2000. J Virol）
最后，作者将拯救的MUV在vero细胞中传代，37℃培养4天能够观察到明显的合胞体形成。
拯救的重组MUV感染vero细胞诱导合胞体形成（D K Clarke et al. 2000. J Virol）
该项研究提供了腮腺炎病毒（MUV）的微基因组报告系统和cDNA感染性克隆的拯救方法。该系统也可为免疫和生物活性蛋白、肽和 RNA 的体内表达提供安全有效的病毒载体。
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