大家好，今天给大家分享一篇文献《Construction and Rescue of a DNA-Launched DENV2 Infectious Clone》。
简介：黄病毒是一大类昆虫传播的病毒，对世界大部分地区的人类造成健康风险。登革热病毒（DENV）在热带和亚热带地区通过受感染的蚊子叮咬传播。超过30亿人生活在有感染登革热病毒风险的地区，这使得登革热病毒成为世界上最流行的虫媒病毒之一。登革热病毒感染引起的疾病范围从轻度发热到可导致死亡的出血热或休克。迄今为止，尚无批准用于治疗登革热病毒感染的抗病毒药物。也没有获准用于儿童和老年人的疫苗，而儿童和老年人是重症风险最高的人群。因此，有必要继续开发可用于推进抗病毒和疫苗研发的有利工具。
该研究描述了DENV血清型2型（DENV2）16681毒株的基于CMV 启动子驱动的cDNA感染性克隆的构建和病毒拯救。研究发现将合成内含子引入NS1基因内部可以稳定感染性克隆cDNA质粒在细菌中的扩增。并且该方法可以有效地使用具有成本效益的转染试剂从转染细胞中拯救出来病毒。此外，获救的病毒在常用细胞系中保留了空斑形成能力和生长特性。总之，该研究表明该系统为传统的基于基因组RNA的cDNA感染性克隆提供了一种快速且具有成本效益的替代方案。
首先作者将DENV2 16681基因组(NC_001474.2)插入修饰后的pcDNA6.2载体，将DENV2 16681基因组置于CMV启动子和SV40 polyA信号之间，并在SV40 polyA信号前引入HDV核酶从而产生精确的基因组3'末端。
由于黄病毒基因组中存在毒性序列，往往在细菌中不稳定。因此作者在DENV2基因组3300核苷酸处（NS1基因内）引入合成的内含子序列，从而增加了质粒在细菌中的稳定性。
pcDNA6.2 DENV2 16681毒株质粒图谱（Madeline Holliday et al. 2023. Viruses）
然后，作者将pcDNA6.2 DENV2 16681质粒转染HEK 293T细胞中，转染后48小时病毒滴度可达到2 × 10㊤3 FFU/mL，转染后120小时达到高峰2 × 10㊤6 FFU/mL。
通过检测细胞裂解液中的NS3蛋白表达发现，NS3表达量在转染后120小时达到高峰。并且，NS3蛋白的成功表达说明引入的内含子被切除。
另外，RT-PCR检测上清中病毒RNA中的NS1基因大小，结果显示拯救的病毒和亲本毒的NS1基因大小一致，说明NS1基因中引入的内含子被切除。
然后，作者用免疫荧光检测了转染的HEK 293T细胞中dsRNA的表达，说明存在病毒复制中间体。
有意思的是，拯救的病毒形成的空斑均一性更好，而亲本毒空斑大小差异较大，说明亲本毒在复制时产生了细胞适应性突变。
DENV2病毒拯救（Madeline Holliday et al. 2023. Viruses）
最后，作者比较了拯救的DENV2和亲本毒在Vero-E6、U2OS、Huh7和C6/36细胞中的生长特性。结果显示拯救的DENV2和亲本毒在Vero-E6复制能力没有差异，拯救的DENV2在U2OS和Huh7中比亲本毒更早地达到复制高峰，但拯救的DENV2在C6/36细胞中复制能力略慢于亲本毒。
拯救的DENV2在细胞中的生长特性（Madeline Holliday et al. 2023. Viruses）
从历史上看，黄病毒的cDNA克隆主要通过体外转录拯救系统。然而，这些系统可能既耗时又昂贵。因此，本研究开发了一种基于CMV 启动子驱动的质粒，可以直接转染拯救DENV2 16681毒株。其他黄病毒液可以通过该方法拯救。此外，本研究使用了廉价的PEI转染试剂，这进一步降低了拯救病毒的成本。使用这种策略，我们能够成功拯救类似于亲本病毒的感染性 DENV2 病毒;然而，拯救的病毒产生了更一致的斑块大小，细胞培养物的生长和亲本毒也略有不同。该平台将简化DENV2 的生产和分析，适用于各种应用，包括抗病毒疗法和疫苗的开发。
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