单杂筛库结果分析
我们以Y1HGold-pAbAi系统酵母单杂筛库为例。
实验流程
单杂筛库
01
1. 准备文库
构建诱饵质粒pBait-AbAi，质粒线性化，转化酵母Y1HGold。
2. 自激活检测
将OD600为0.002的Y1HGold[pBait-AbAi]分别涂布到含不同AbA浓度的SD/-Ura平板上。
注：在不同浓度AbA平板上（0，100 ng/mL，200 ng/mL，300 ng/mL，500 ng/mL，800 ng/mL，1000 ng/mL），出现的酵母菌斑最少或完全没有，即为AbA最佳使用浓度（最佳抑菌浓度、最小抑菌浓度、本底表达浓度、自激活浓度）。一般情况下筛库自激活AbA浓度不宜超过800 ng/mL。
3. 制备Y1HGold[pBait-AbAi]感受态、筛选DNA文库
（1）筛库所有克隆计算：取50 μL筛库重选菌体梯度稀释，浓度分别为1/10，1/100，1/1000，1/10000，每个浓度分别取100 μL涂布SD/-Leu、SD/-Leu/AbA两种平板（Φ90 mm）。
（2）文库筛选克隆数=[cfu/mL on SD/-Leu]×[稀释倍数]×[重悬体积(15 mL)]
（3）筛库阳性克隆检测：筛库剩余重悬菌体全部涂布SD/-Leu/AbA平板（Φ150 mm），与自激活浓度相比，筛库平板AbA浓度应高出50 ng/mL。
4. 筛选阳性克隆：
（1）菌落PCR鉴定互作酵母菌株：选择直径约为2~3 mm的克隆，菌落PCR扩增，引物为pGADT7-F/R，PCR体系和程序参见酵母阳性克隆快速检测试剂盒（货号：SK2420）。
（2）复筛鉴定互作酵母菌株：电泳条带大于400 bp（根据实验目的和实际情况而定）的单菌落，划线于SD/-Leu/AbA培养基上。有多条电泳条带的单菌落（含有多个质粒的转化子），需要在SD/-Leu/AbA筛选培养基上重复划线培养2-3代，然后通过菌落PCR的方法选出具有单个质粒的克隆。
过少
阳性克隆
02
文库转化效率低
看筛库SD/-Leu平板。克隆数目越多，代表文库转化效率越高，转化效率高意味着有更多的文库基因参与到互作筛选中，直接影响筛选到的阳性克隆数目。同理，如果SD/-Leu平板克隆数目少，SD/-Leu/AbA筛库阳性克隆也会很少。理论上讲SD/-Leu平板至少要有1.0×106个克隆，如果克隆数较少，会降低筛选到阳性克隆的概率。有研究表明30万个克隆也能筛选到阳性克隆。
转化效率低，主要是因为感受态和文库的质量不行、转化方法不适合或者操作有问题，这一点可以参考前期内容，有关于转化方法选择的讲解。
文库本身的质量问题
比如建库选择的材料的取材、建库方法等等。对应的，需要检查一下文库，比如以文库质粒为模板进行PCR，看看能否扩增出目标蛋白基因。
互作本身比较少
如果前两点都没出现问题，那么就可能是互作本身比较少，所以筛到的克隆少，建议查询相关文献。
过多
阳性克隆
03
自激活未被抑制完全
比较筛库的SD/-Leu和SD/-Leu/AbA板子，如果两个板子克隆数目近似，说明自激活那一步骤选择出的AbA浓度可能较低，自激活没有被抑制完全。这种情况建议重新做一下自激活。
存在假阳性
在新的SD/-Leu/AbA平板上面划线，不生长或不能正常生长的单菌落为假阳性。注意，需要通过菌落PCR来保证获得的克隆具有目标质粒，若具有多个质粒，需要重复划线。
存在重复克隆
一些单克隆菌P测序，将序列比对后发现是一个基因。
筛到的多但是互作弱
加大AbA浓度来筛选数目更少且互作更强的克隆。
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