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两种方法回转验证
酵母单双杂小课堂
回转验证应该选择哪种方法？
回转验证是指筛库之后对阳性克隆再次确认，也称作点对点互作验证。
回转验证实验中，AD 载体有两种形式：
一是文库质粒。就是从阳性克隆中（筛库得到的）提取出来的AD文库质粒
二是互作基因 CDS 片段重新构建的 AD质粒。就是将上述AD文库质粒进行PCR，在NCBI上比对，将 CDS 片段重新构建 AD质粒。
举例：
以互作基因 CDS 片段重新构建 pGADT7 质粒为例，进行点对点互作验证。将上述 PCR 产物送公司测序，使用 BLAST 序列比对工具在线分析阳性克隆的测序结果，通过 NCBI 在线 Blast 分析互作基因CDS 片段，然后设计引物，以 cDNA 为模板（建库时的 cDNA），PCR 扩增互作基因 CDS 片段（Prey），双酶切重新构建 pGADT7 载体，与 pGBKT7-Bait 共转化 Y2HGold 菌株。然后梯度稀释点接显色平板，进行互作结果分析。
两种AD质粒形式怎么选择：
首选互作基因 CDS 片段重新构建的 AD质粒，因为AD文库质粒携带的互作蛋白是不完整的，而且有移码导致假阳性的可能性。
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