教程 | EGY48-LacZ系统酵母单杂互作验证

酵母单杂互作验证实验常用系统有Y1HGold-pAbAi、Y187-pHis2和EGY48-LexA，每个系统的使用方法有较大差异，本期我们以EGY48-LexA为例进行分析。

根据大量实验经验，Coolaber公司为大家提供一个优化的EGY48-LexA系统酵母单杂互作验方案（货号：YH3010），本方案可分为三个主要步骤：Bait和Prey共转化EGY48，阳性克隆鉴定，互作验证，方案中有较详细的实验流程。此外，本方案还对常见的互作验证结果进行了分析，有需要的读者建议读到最后哦。

注：

1. 本试剂盒可用于10对单杂互作验证（质粒除外）。

2. 注意每个成份的保存温度，感受态细胞务必-80℃保存。

3. 0.5 L×2表示：2个包装，每个包装0.5 L；5×1 mL表示：1个包装，含5个1 mL。

4. pLacZi是否酶切线性化之后转入EGY48，根据实际情况而定。

本试剂盒提供的产品以产品组成为准，部分试剂和耗材需要自备，也可以在Coolaber公司单独购买。

1. 灭菌的枪头（1000 μL、200 μL、10 μL）、涂布棒或玻璃珠，Φ90 mm培养皿，备用。

2. Carrier DNA在95-100 ℃水浴5 min，后快速冰浴，可再重复一次，备用。

4. 自备0.9%生理盐水，可用ddH₂O无菌水代替，备用。

5. 普通平板制备

将1条培养基溶于0.5 L去离子水中，无需调节pH值，高压灭菌（如，115 ℃灭菌20 min）。液体培养基4 ℃冰箱保存；固体培养基，20-25 mL/块倒平板（Φ90 mm），凝固后4 ℃冰箱保存。

6. 显色平板配制

参考YK3010 LacZ基因胞外表达显色试剂盒说明书。

1. 挑取甘油保存的对照菌液（10-50 μL）于SD/-Trp/-Ura平板上划线，28-30 ℃培养3-5 d，培养出来的单菌落可直接用于互作验证实验。

2. 挑取上述单菌落于SD/-Trp/-Ura液体培养基中，200 r/min、28-30 ℃振荡培养2 d，OD600应大于1，取1 mL菌液集菌，弃上清，加入0.2 mL 15%甘油，-80 ℃可长期保存。

注：EGY48单杂阳性菌使用SD/-Trp/-Ura培养基培养。

EGY48-LacZ系统酵母单杂互作验证实验方案较多，Coolaber公司根据多年经验，给出一个较优方案，首先我们将自激活检测，毒性验证放在互作检测之后（本方案不作分析）。略过载体构建，分为三个步骤：Bait和Prey共转化EGY48，阳性克隆鉴定，互作验证。本方案仅适用于酵母小规模转化，大规模转化，请先做自激活和毒性实验，此外，本方案还对常见的互作验证结果进行了分析。

3.1 Bait和Prey共转化EGY48

AD-Prey、AD-Empty、pBait-LacZi和Empty pLacZi空载（或Mutant Bait pLacZi）测序后，将其大肠杆菌菌液进行扩大培养，然后提取质粒。

1. 取100 µL冰上融化的EGY48感受态细胞（货号：CC302），依次加入预冷的质粒Bait和Prey（各1-2 µg），Carrier DNA 10 µL（95-100 ℃，5 min，快速冰浴，重复一次），PEG/LiAc 500 µL并吸打几次混匀，30 ℃水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。

2. 将管放42 ℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。

3. 5000 rpm离心40 s弃上清，ddH2O 400 µL重悬，离心30 s弃上清。

4. ddH2O 50 µL重悬，涂板SD/-Trp/-Ura平板，30 ℃培养3-5 d（同时，将EGY48阳阴性菌株于SD/-Trp/-Ura平板划线活化）。

5. 实验组和对照组的设置参考表1。

表1 共转化的实验组和对照组

注：对照组1*可以更好的体现实验组是否互作。对照组2**诱饵菌株可以是EGY48[Mutant Bait pLacZi]也可以是EGY48[Empty pLacZi]，可以避免诱饵序列突变（或无诱饵）的情况下，猎物直接激活报告基因而造成的假阳性，这种假阳性并不多见，可以省略。

3.2 阳性克隆鉴定

此步骤可以省略。详细步骤可参考SK2420酵母阳性克隆快速检测试剂盒，引物可根据实际情况设计。

3.3 互作验证

1. 上述的转化成功之后，每个样品挑取新鲜单菌落（2-3 mm）于1 mL 0.9% NaCl溶液中重悬，OD600调至0.2（也可以用SD/-Trp/-Ura液体培养基培养至OD600=0.2）。

2. 再用0.9% NaCl溶液依次稀释10倍，100倍，1000倍（即OD600=0.2，0.02，0.002，0.0002）。

3. 按照先实验组后对照组的顺序，分别点板10 μL于相应的SD/-Trp/-Ura和SD/-Trp/-Ura/Gal/Raf/X-Gal平板，参考图1。

4. 30 ℃培养2-3 d，观察每组重组酵母在平板上生长状况和颜色深浅，从而确定是否互作。

4.1 互作

由图1可知，在SD/-Trp/-Ura平板上，对照组EGY48[Positive LacZi+ Positive AD]和EGY48[Positive LacZi+AD]长势相同。在SD/-Trp/-Ura/Gal/Raf/X-Gal平板上，EGY48[Positive LacZi+ Positive AD]长势明显优于EGY48[Positive LacZi+AD]，且显蓝色，所以Positive LacZi与Positive AD具有互作。同理，Bait1和Prey1也有互作。

4.2 无互作

由图1可知，EGY48[pBait2-LacZi+AD-Prey2] /EGY48[pBait2-LacZi+AD]和EGY48[pBait3-LacZi+AD-Prey3] /EGY48[pBait3-LacZi+AD]在所有的SD平板上，长势都相同，所以Bait3与Prey3无互作，Bait2与Prey2无互作。

4.3 Prey蛋白有毒性

由图1可知，在SD/-Trp/-Ura平板上，EGY48[pBait4-LacZi+AD-Prey4]长势弱于对照组EGY48[pBait4-LacZi+AD]，可能是Prey蛋白有毒性导致；但是在SD/-Trp/-Ura/Gal/Raf/X-Gal平板上，EGY48[pBait4-LacZi+AD-Prey4]长势优于EGY48[pBait4-LacZi+AD]，且显蓝色，所以Bait4与Prey4有互作。

注：酵母杂交互作验证实验，不适于毒性很强的Prey蛋白。

4.4 Bait有自激活

EGY48[pBait2-LacZi+AD-Prey2]和EGY48[pBait2-LacZi+AD]在所有的在SD平板上长势均相同，且能够显蓝色，所以Prey2具有较强的自激活。EGY48[pBait5-LacZi+AD-Prey5]和EGY48[pBait5-LacZi+AD]在SD/-Trp/-Ura平板上长势相同，在SD/-Trp/-Ura/Gal/Raf/X-Gal平板上，实验组组较对照组的颜色更深，所以Bait5和Prey5有互作，虽然Bait5也有一定的自激活。解决自激活更多问题解答可参考官网：酵母杂交实验常见问题——单杂知识及自激活检测篇。

本方案结合LacZ基因胞外表达显色试剂盒进行互作验证，采用稀释点板的方法，与涂板的方法相比，更能直观的体现出DNA和蛋白的互作，还能减少培养基的使用。在酵母单杂实验中，如果Bait有较强的自激活现象，我们更推荐Y1HGold-pAbAi系统，Y1HGold报告基因为AbAr，不仅可以很好的抑制诱饵自激活，而且能大大降低酵母单杂假阳性的概率。更多问题解答，可联系Coolaber公司：

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