Nature子刊 | 抗肿瘤耐药机制探索:碱基编辑筛选揭示药物耐药机制的遗传图景

学术   2024-10-29 18:10   北京  

【CMT&CHTV 医学前沿·临床经典】


导语:药物耐药性一直是限制抗肿瘤治疗长期有效性的主要障碍。近期,一项发表在Nature Genetics上的研究利用CRISPR基因编辑技术,前瞻性地识别了十种肿瘤药物耐药性的遗传机制,为癌症的精准治疗提供了新的视角。

2024年10月,Nature Genetics发表了题为“Base editing screens define the genetic landscape of cancer drug resistance mechanisms”的研究文章,通过CRISPR碱基编辑技术,深入探索癌症药物耐药性的遗传基础,并前瞻性地识别出调控肿瘤细胞对十种不同抗癌药物敏感性的遗传变异。


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研究背景


肿瘤治疗中,尤其是分子靶向治疗,耐药性的出现常常导致治疗失败。耐药性的形成往往与肿瘤基因组中的单核苷酸变异(SNVs)有关,这些变异可能影响药物靶点或同一信号通路中的蛋白质。目前,研究者主要通过分析治疗后的患者肿瘤活检样本来追溯耐药性的遗传基础,但这一过程耗时且样本获取困难。因此,快速、前瞻性且系统地对变异进行功能性注释,对于加速发现耐药机制至关重要。CRISPR基因为编辑技术,如碱基编辑,为直接解释未知意义变异(VUS)的功能提供了可能,并用于研究对细胞因子和抑制剂的耐药性遗传机制。

抗肿瘤治疗耐药性通常由肿瘤基因组中的SNVs引起,这些变异导致药物靶点或同一信号通路中的蛋白质发生点突变。对耐药性的研究有助于阐明药物的作用机制、设计针对耐药蛋白的第二代抑制剂、开发联合疗法以及对患者进行分层以进行二线治疗。

目前的方法通常依赖于对治疗后复发的患者的肿瘤活检样本进行测序。这些样本难以获取,意味着可能需要数年时间才能积累足够的样本量来推断变异功能。这些分析通常限于频繁观察到的变异,并且必须逐个进行实验验证,以建立与耐药性的因果关系。这是一个缓慢的过程,不允许直接比较不同变异效应。这些挑战限制了对癌症活检和循环肿瘤DNA测序数据的解释。快速、前瞻性和系统的变异功能性注释将加速发现耐药机制。

CRISPR基因编辑技术,如碱基编辑,可以用来直接解释未知意义变异(VUS)的功能,并研究对细胞因子和抑制剂的耐药性遗传机制。胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器使用与脱氨酶融合的Cas9切口酶,以高效率在生理相关的细胞类型中程序性地安装C>T和A>G SNVs。在本研究中,研究者大规模使用碱基编辑技术来研究对分子靶向癌症治疗的获得性耐药的遗传机制,识别出赋予药物耐药性和药物敏感性的VUS。将调节药物敏感性的癌症变异分类为四种功能类别,从而为解释耐药机制提供了一个系统的框架。

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研究设计


研究采用了CRISPR碱基编辑技术,通过向四个癌症细胞系中引入一个导向RNA(gRNA)库,预计在11个癌症基因中安装32 476个变异,以识别调控药物敏感性的蛋白质变体。研究团队通过单细胞转录组学揭示了这些变体如何通过不同机制发挥作用,包括引发药物成瘾的细胞状态。研究涉及的癌症药物包括美国食品药品监督管理局(FDA)批准的和正在临床研究中的十种分子靶向抗癌药物。

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研究结果


研究结果揭示了四种功能类别的蛋白质变体,它们调节了药物敏感性。分类为:

(1)在药物存在下赋予增殖优势但在无药物存在下有害的“药物成瘾变体”;
(2)仅在药物存在下赋予增殖优势的“典型耐药变体”;
(3)在药物存在和不存在下都赋予增殖优势的“驱动变体”;
(4)仅在药物存在下有害的“药物增敏变体”。

研究团队观察到四种类别的变体全都参与调节了MEK1/2抑制剂曲美替尼的敏感性(图2a)。此外,研究还发现了可以通过替代抑制剂靶向的变体来克服耐药性,并在肺癌细胞中功能性验证了一种使表皮生长因子受体(EGFR)变异,该变异使细胞对EGFR抑制剂敏感(图5)。

图1 四个功能的变体

  药物耐药性与敏感性的分子机制


研究团队进一步探索了药物耐药性与敏感性的分子机制。他们发现,药物成瘾变体主要激活了MAPK信号通路中的癌基因,如KRAS Q61R/E62G和MEK2 Y134H,这些变异在没有药物抑制的情况下导致细胞生长缓慢,与药物成瘾现象一致(图2d)。而典型耐药变体,如MEK1 L115P和EGFR S464L,位于药物结合口袋内,与药物结合受阻有关(图2c)。此外,研究还发现了一些驱动变体,如AKT1 E17K和PIK3CA E545K/E542K,这些变异位于已知的热点区域,并且能够引起药物耐药性(图3a)。

图3 耐药性的驱动变量

  PARP抑制剂耐药性机制的发现


在研究PARP抑制剂的耐药性机制时,研究团队发现,耐药性主要通过PARP1上的靶点药物耐药性变异来介导,而不是PARP2或其他靶基因。特别是,PARP1的I691T变异在两种PARP抑制剂Olaparib和Niraparib的筛选中都表现出增敏作用(图4a)。这些发现为PARP抑制剂的耐药性提供了新的见解,并可能有助于开发新的治疗策略。

图4 PARP1中的耐药性和药物致敏变体

  EGFR抑制剂耐药性与敏感性的深入分析


研究还深入分析了EGFR抑制剂的耐药性与敏感性。研究团队发现,EGFR的C末端截断变异能够增加对EGFR抑制剂的敏感性,这些变异导致EGFR蛋白表达水平的变化,并且与药物抑制效果有关(图6)。此外,通过Prime Editing技术,研究团队还发现了EGFR T790M变异,这是对第一代EGFR抑制剂Gefitinib产生耐药性的关键变异。

图5 EGFR中的耐药性和药物致敏变体

图6 EGFR C末端截短变体对EGFR抑制剂敏感

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总结讨论


研究强调了CRISPR碱基编辑技术在识别癌症药物耐药性中的潜力。通过这项技术,研究者不仅能够识别出已知的耐药机制,还能发现新的变异,这些变异在体外导致了药物耐药性的产生。此外,通过单细胞转录组学的应用,研究者能够进一步理解这些耐药变体如何通过不同的分子机制影响细胞状态。这些发现对于患者分层、治疗组合和癌症治疗中的药物安排具有重要意义,为未来的癌症治疗提供了新的策略和方向。

参考文献
COELHO M A, STRAUSS M E, WATTERSON A, et al. Base editing screens define the genetic landscape of cancer drug resistance mechanisms[J]. Nat Genet. 2024-10-18. DOI:10.1038/s41588-024-01948-8.

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编辑:赤芍
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