近年来的研究表明，细胞内良好的机械微环境是细胞行为的有力调节器——有助于前体细胞分化成具有特定结构的多细胞组织，是再生医学研究的热点。天然材料如胶原蛋白，具有生物活性、生物可降解性和细胞粘附性等优势，但因其机械性能较差限制了应用。此前我们向大家介绍过可以通过多种方法制作胶原蛋白凝胶（点击阅读：重组胶原的“升级之路” - 胶原水凝胶），如通过化学交联剂（如戊二醛）、物理交联（如伽马射线辐射），以及脱水热处理（DHT）等。尽管这些方法使胶原蛋白在机械性能方面取得了不同程度的加强，但同时引出了细胞毒性、成本较高和反应时间过长等问题。在过去十年中，合成光敏生物材料已得到开发，紫外（UV）光交联水凝胶正引起越来越多的关注。其优点在于，①有效且快速，当胶原暴露在UV光下，双键和芳香环就能产生自由基，在氨基酸上形成的自由基形成胶原蛋白分子间的共价键，凝胶化时间非常短。②光交联产生的副产品极少，为结构和安全性提供了保证。通过与甲基丙烯酸酐酯化引入甲基丙烯酰氧基团是制造光交联聚合物最常见的方法。甲基丙烯酰氧基团结合的第一个步骤涉及胶原蛋白分子上的自由胺基和羟基与甲基丙烯酸酐之间的反应。通过添加光引发剂（Irgacure 2959等），暴露于UV光触发交联，在甲基丙烯酰氧基团之间形成交叉链接，自组装成水凝胶。
UV光交联前通过质子核磁共振（Proton NMR）显示在5.3和5.6ppm处检测到大峰，表明甲基丙烯酸衍生化到自由胺基成功，接近6ppm的较小峰提示活性侧基也发生了衍生化。胶原蛋白甲基丙烯酰胺（以下简称CMA）的NMR谱图与天然胶原蛋白几乎相同，证实在合成和纯化过程中没有发生其他显著反应（见下图）。使用三硝基苯磺酸（TNBSA）测定法对自由胺基进行定量，显示大约20%的自由胺基被转化为甲基丙烯酰胺基团。光交联的整个过程较为复杂，有兴趣的读者可以参考：10.1007/s13758-012-0025-y这篇文章。
CMA在UV光交联期间的实时流变学数据如下图所示。在37°C孵化后约200-300秒储能模量（G'）增加，表明材料自组装成纤维状水凝胶。在UV光照射后G'迅速增加五倍，证实CMA具光敏功能。在照射期间观察到损耗模量（G"）的小幅振荡增加，而在90秒曝光后，G"略低于光交联前。交联后G'大幅增加，而G"的轻微减少，表明光交联导致材料在机械性能上更硬且更有弹性。
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下图左边展示了UV曝光时间对CMA机械性能的调节作用，30秒、45秒和90秒的曝光分别导致CMA储能模量增加了30%、60%和100%。右边展示了动态控制，六个不同的15秒UV曝光周期逐步增加储能模量（最大值的约5%、30%、60%、80%、90%、100%），以及在移除光源后立即保持稳定的模量。
扫描电镜（SEM）显示，CMA和天然I型胶原蛋白以及光交联CMA的纤维形成相似（见下图，A：CMA；B：光交联后CMA；C：天然胶原蛋白）。没有观察到纤维大小、方向或数量的实质差异，进一步表明甲基丙烯酸化反应在很大程度上保留了胶原蛋白的四元结构，光交联过程也没有显著改变纤维的超微结构。
圆二色谱（CD）光谱学分析表明，与天然胶原蛋白相比，CMA的椭圆率在特征性的221 nm峰处没有显著差异，表明两种材料中α-螺旋的浓度相同（如下图，圆圈和方块分别代表天然胶原蛋白和CMA，菱形代表作为参照的0.02N乙酸）。
酶降解测定显示，天然胶原蛋白和CMA间的酶降解率没有统计学差异，但光交联CMA的酶降解率显著低于天然胶原蛋白和未交联CMA。天然胶原蛋白（72.8%降解率）在3小时后降解最多，其次是CMA（55%），最后是光交联CMA（35.9%），说明光交联CMA的稳定性。
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细胞毒性检测（封装密度为1×10^5个细胞/mL）显示，在UV光暴露后24小时和72小时。如上图所示，未暴露于UV/光引发剂的天然胶原蛋白对照条件下观察到的成人间充质干细胞（hMSC）存活率最高（24小时和72小时分别为98%和97存活），而在光交联CMA条件下，在24小时时存活率显著下降（71%），但在72小时时恢复到81%。遗憾的是，没有比较非交联CMA和光交联CMA的区别，有可能毒性来自于CMA本身，而并非来自于交联的特性。
应用UV光交联制得的胶原蛋白甲基丙烯酰胺水凝胶具有自组装、生物相容等特点，并在很大程度上保留了原胶原蛋白的纤维结构和空间特征。重要的是，在活细胞存在的情况下，该材料可通过光改变机械性能——仅用UV光照射90秒，储能模量就增加了五倍，此外还可通过调整曝光量来轻松调节硬度，使胶原蛋白在机械性能上获得质的提升。
在我们测试自研的重组胶原蛋白水凝胶细胞活性时，其与化学交联的I型胶原蛋白有相同的细胞增殖率，也表明交联本身并不会造成细胞死亡或活性下降，但水凝胶形成的空间结构是随机杂乱的，也许会阻碍细胞在孔隙中获得足够的养分，导致细胞的分化或衰亡。因此当水凝胶或者交联胶原微球作为细胞培养载体应用时，应考虑孔隙率或者比表面积作为质量指标。
在未来的文章中，我们也会继续分享胶原蛋白的前景及技术特点。请持续关注HEROSTEM®LAB汇融实验室及旗下BETAGENE GENETIC贝融生物，我们会陆续发布更多产品进展以及研究成果。
上海汇融细胞科技有限公司（HEROSTEM® LAB，汇融实验室®）位于上海·外高桥自贸壹号生物园，我们于 2012 年成立，致力于细胞与基因工程技术在生命科学与生物美容领域的创新与探索。我们的产品包括了层析填料、工业级生物试剂、医疗美容产品的材料以及制剂品。我们的团队具备跨界、跨行业的从业背景，涵盖了重组蛋白、医美制剂配方、细胞药物等。HEROSTEM®LAB汇融实验室®的重组蛋白工厂已于 2022 年正式投入GMP运营，并获得ISO9001与ISO13485的认证。 随着生物科技的不断发展，医疗美容领域内产生了众多的创新产品，HEROSTEM®LAB汇融实验室®已成功研发了重组胶原蛋白水凝胶、注射用羟基磷灰石填充剂、琼脂糖填充剂等产品。这类创新生物材料正以迅猛的更迭速度改变着人们对整形美容的认知和需求。更多信息，请查看我们的官网：www.herostem.com.cn。HEROSTEM® Inc., an innovation biotechnology company, is based in Shanghai, China. The laboratory initiated stem cell study and clinical applications back in 2007. Combining stem cell and genetic engineering platforms, HEROSTEM continues to deepen its research and development in the field of bio-based aesthetics, and has launched more than 20 regenerative aesthetic SKUs.
BETAGENE® Genetic, a Shanghai-based innovation-driven company and a subsidary of HEROSTEM®, is a global reagent and hydroxyapatite supllier. We provide and market a wide range of GMP recombinant proteins, enzymes, customized proteins and hydroxyapatite sphere through genetic engineering and biosynthesis . The company has developed several recombinant expression systems including bacterial, yeast, insects and mammalian.We specialize in making animal-free GMP products for cell and gene therapy, antibody, vaccine, IVD, cosmetics and tissue engineering industries. Specially designed and customized proteins are available upon requests.
