在之前的文章中（机械转导 - 羟基磷灰石的再生机理）我们介绍了羟基磷灰石（CaHA）的再生机理，其中一位研究人发现羟基磷灰石（主要是 Radiesse）对比起 PLLA，有着同样的炎症反应，这个结论与大量的安全性回顾文章相悖，很值得关注。我们在之前的另一篇炎症文章中（点击阅读：羟基磷灰石微球炎症刺激）也简单地描述了羟基磷灰石微球与炎症的关系。今天我们更加深入地研究一下羟基磷灰石微球在体内引起的免疫反应。
外来材料植入体内均会激活各种免疫反应，这一反应因填充剂类型、物质组成和患者的免疫状态而异。作为生物陶瓷材料，我们一般认为羟基磷灰石在免疫学上是惰性的，即具有最小的免疫细胞招募和激活。上一篇文章中，也探讨了羟基磷灰石在体内的再生机理是机械转导，而非炎症刺激。
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多项既往研究提示，羟基磷灰石没有形成肉芽组织或引起显著的异物反应（点击阅读：肉芽肿？不一定是羟基磷灰石的锅），在已上市的羟基磷灰石产品治疗后1个月和6个月，炎症细胞激活较少（见上图 A左），同时胶原蛋白染色强度增加（蓝色）。注射后6个月时（上图 A 右），观察到胶原蛋白显著增加，但免疫细胞并没有增多。羟基磷灰石被稳态降解，观察到巨噬细胞介导的吞噬作用是主要的清除机制（上图B，巨噬细胞介导的羟基磷灰石微球分解证据）。
Berlin等人认为羟基磷灰石激活免疫细胞的方式与其他填充剂显著不同，其对早期巨噬细胞激活最小，而聚左旋乳酸（PLLA）和透明质酸（HA）凝胶后的早期巨噬细胞激活可能更显著。Zerbinati和Calligaro观察到羟基磷灰石治疗后几乎没有免疫细胞激活，指出没有与填充剂植入相关的炎症形成，治疗是安全、再生的，没有免疫系统刺激。
Mazzuco等人开展了一项研究，纳入了五名女性，分别在左臂皮下浅层注射聚左旋乳酸（Sculptra），右臂皮下或皮下浅层注射羟基磷灰石（Radiesse）。经过三次治疗后，组织学结果显示，两种填充剂颗粒附近均观察到中度至重度淋巴细胞和巨大细胞浸润，以及胶原和弹性纤维的新形成。真皮没有炎症或纤维改变。如下图所示，注射羟基磷灰石的四个标本中，组织学检测与聚左旋乳酸相似，呈现颗粒周围和颗粒之间有中度至重度的异物反应。下图 A 的炎性反应小于下图 B。用HE染色的切片在400倍放大，用偏振光观察：（A）巨大细胞反应包围了CaHA的圆形颗粒和（B）PLLA的不规则颗粒。观察到一些细胞正在吞噬两种填充剂的颗粒。
上图为羟基磷灰石活体组织学切片HE染色（A）40倍放大，在皮下层观察到围绕羟基磷灰石颗粒的重度炎症反应。（B）天狼星红染色40倍放大（C）Verhöeff-van Gieson染色40倍放大，真皮中无炎症反应或新胶原形成的证据。用HE染色（A）在100倍放大，对炎症反应进行详细观察，显示有包围羟基磷灰石微球颗粒的巨大细胞反应，以及一些细胞的吞噬作用。（B）天狼星红染色在100倍放大，巨大细胞炎症过程中观察到新胶原形成反应，（C）Verhöeff-van Gieson染色400倍放大示，在炎症反应中缺乏弹性纤维。
与开头提到的羟基磷灰石引起轻微炎症或无炎症反应的研究相反，该研究发现羟基磷灰石可引起中度至重度巨大细胞炎症反应。此外，Holzapfel等也描述了羟基磷灰石注射在皮下后的淋巴细胞和巨大细胞浸润；Moulonguet等人描述了从两例患者脸颊和鼻中隔切除羟基磷灰石结节，这些患者在皮下和肌肉组织中呈现强烈的异物反应，归为不良事件。
在上面这些证据中，都用到了活体检测，我们认为这个属于安全性数据的黄金标准，虽然案例有限，但相较于动物实验更加接近人体真实反应，值得关注。
要分析上述矛盾的结论，我们有必要了解下免疫系统对不同大小、形状粒子的应答。既往研究表明，机体内，对大于0.5微米的粒子一般通过吞噬作用摄取；较小的粒子则通过内吞作用（见下图）。粒子的形状、大小是吞噬作用的重要决定因素。![]()
上文已提到，巨噬细胞介导的吞噬作用是羟基磷灰石的主要清除机制。对于免疫吞噬细胞而言，太大而无法摄取的粒子会导致吞噬过程停滞，称为受挫的吞噬作用，可导致溶酶体酶和活性氧（ROS）在细胞外环境中释放，这些内容物的释放可能会触发炎症和组织损伤。在形状方面，有学者测试了大量的粒子，证明相比大小，形状对细胞摄取的影响更大，球形的摄取效率比任何其他伸展形状的摄取效率更高。现有证据似乎表明，球形粒子直径在约3μm时，可获得最有效的吞噬作用。以上市的Radiesse为例，其主要成分羟基磷灰石微球直径为25-45μm，按这一标准大颗粒的羟基磷灰石或可能造成吞噬作用受阻而引起炎症，不过目前的研究仍无法明晰巨噬细胞吞噬羟基磷灰石晶体的具体机制。粒子的炎症激活还取决于粒子的表面属性。表面粗糙的粒子（如二氧化硅、碳黑等）可以破坏溶酶体和吞噬体膜，从而引发炎症体激活，羟基磷灰石颗粒在光滑度上比较均匀，因此理论上引发炎症的几率较低。尺寸较小的纳米粒子更有可能激活炎症反应，原因是它们具有更大的表面积/质量比。有研究显示，小于1-2μm的羟基磷灰石晶体比6和14μm大小的粒子在培养的人类原代巨噬细胞中引起了更多的TNF-α释放，研究者推测可能是纳米级材料更能有效激活炎症反应。考虑到这些因素，目前医美上使用的羟基磷灰石更多是以微球形式造粒，而非纳米颗粒，且空隙率不高。基于小鼠的研究提示，与微米级粒子相比，约50nm大小粒子，如卵清蛋白（OVA）偶联聚苯乙烯，更有可能在小鼠中启动 CD4+ T细胞Th1激活，而微米级粒子更倾向于触发Th2反应。Th1细胞分泌促炎症细胞因子，如IFN-γ和TNF-α；Th2细胞分泌更多的抗炎细胞因子，包括IL-4、IL-5、IL-10和IL-13，Th2细胞产生的IL-10还具有抑制Th1和巨噬细胞的功能。需要指出，粒子形状和拓扑结构也对激活炎症反应起到决定性作用，例如，二氧化钛粒子表面的纳米尖峰在小鼠中导致了Th1反应，尽管这些粒子的大小在微米范围内。羟基磷灰石对CD4+ T细胞分化（Th1和Th2）的效应仍不确定。![]()
那么为何活体检测中有炎性反应的存在？我们怀疑羟基磷灰石微球在机体内的免疫反应不确定性可能来自于其持续的粒子释放。羟基磷灰石微球可通过多种工艺可以生产，其本质是将无数众多更加微观的羟基磷灰石晶体组成一个圆球，再通过一些方法进行打磨和塑造，使其定型。一些工艺步骤，如打磨，会使得羟基磷灰石表面沾有大量的细微颗粒，而如上文所讲，这些纳米级的晶体会更容易引发免疫反应。另外，这些微球在体内随着弱酸环境逐渐崩解，而释放出来的粒子也会引起免疫反应（如上图红箭头），因此要考虑构成这些微球的最小的单元尺寸，如果微球直接崩解为纳米颗粒，免疫反应可能更高；如果微球先是分裂成较大的碎片，此时还无法启动吞噬，然后再缓慢崩解为纳米颗粒，这个免疫过程可能相对温和。综合来看，羟基磷灰石微球仍可视为低炎症潜力材料，这也符合目前多数的免疫学研究结果。对临床从业者而言，羟基磷灰石微球的安全性总体良好，纳入2004年至2015年相关研究的汇总分析表明，该疗法未发现严重不良事件、感染或超敏反应的报道。不良事件的发生率仅为3%，其中结节是出现最多的不良事件，这可能是由填充剂的错误定位、肌肉或重力引起的移位或积聚等因素引起。我们在既往的文章（羟基磷灰石安全性分析）中详细介绍了对可能出现的并发症的治疗方法。未来我们会继续分享羟基磷灰石及其在医美、环保、涂料等多个领域的创新应用，以及这类微球作为注射材料的新思考、新灵感。请持续关注Herostem Lab汇融实验室及其下属单位BETAGENE Genetic贝融生物的研发进展。上海汇融细胞科技有限公司（HEROSTEM® LAB，汇融实验室®）位于上海·外高桥自贸壹号生物园，我们于 2012 年成立，致力于细胞与基因工程技术在生命科学与生物美容领域的创新与探索。我们的产品包括了层析填料、工业级生物试剂、医疗美容产品的材料以及制剂品。HEROSTEM®LAB汇融实验室®的重组蛋白工厂已于 2022 年正式投入GMP运营，并获得ISO9001与ISO13485的认证。 更多信息，请查看我们的官网：www.herostem.com.cn。
