汇融全家桶 2：琼脂糖羟基磷灰石凝胶
文摘
科学
2024-09-12 14:03
上海
汇融实验室的全家桶中，重组蛋白、羟基磷灰石和琼脂糖三个技术平台让我们能够创造出比较有趣和新颖的新材料。之前的文章中（点击阅读：1+1=？汇融实验室的全家桶），我们描述了通过添加胶原蛋白，得到既有琼脂糖凝胶特性，同时又具有较高粘度值的琼脂糖-胶原蛋白复合凝胶（ColAga）。那么将琼脂糖和羟基磷灰石搭配在一起，会创造出什么新咖？
对于小型骨缺陷（即<6 mm），骨组织可以自发再生修复，当损伤超出这个范围时，通常需要组织替代疗法，如自体移植或同种异体移植进行修补。虽然骨移植是常见的治疗方案，但存在不可忽视的缺点：自体移植受到组织可用性的限制，而同种异体移植则导致免疫反应和炎症，甚至引起组织排斥。以上这些限制可以通过骨组织工程（BTE）来克服，它包含三个要素：支架、细胞和生长因子。BTE支架是3D多孔材料，可暂时作为受损组织的替代品，同时促进细胞附着、增殖和分化。支架必须是生物相容且可生物降解的，在形态上应模仿所替代组织的结构（宏观和纳米结构共存）、孔隙率、机械性能；此外，支架应具有促进成骨分化作用。在一系列可用于BTE支架的材料中，琼脂糖（Aga）因其凝胶化行为、高生物相容性、模仿骨骼细胞外基质（ECM）和促进细胞增殖等优势，而在组织工程领域受到关注（点击阅读：填充剂搅局者-琼脂糖AGAFILLER）。羟基磷灰石（CaHa）是骨骼的主要无机成分，对骨组织再生至关重要，具有刺激生长因子和碱性磷酸酶的功效，此外还提高组织的机械性能。利用两者的优势，将 Aga 与 CaHa 合二为一，琼脂糖-羟基磷灰石复合凝胶（AgaCaha）就此诞生。既往研究证实，AgaCaHa复合材料在骨组织再生方面是有效的，可引起活跃的细胞反应，并且无细胞毒性，但这些研究并未以BTE支架为目的进行测试。此外，有研究发现超临界干燥的凝胶可获得特殊表面积，显著大于冷冻干燥法。基于此，近期有学者首次使用超临界二氧化碳辅助干燥生产AgaCaHa复合材料，以创建一个多孔结构来承载填料。并对琼脂糖和羟基磷灰石的不同比例组合进行形态、化学组成和机械性能的分析，旨在确定最适合骨组织再生的组合。首先，通过将聚合粉末溶解在蒸馏水中，制备了1%和4%浓度琼脂糖（Aga）水凝胶。随后使琼脂糖溶解，倒入钢模中，并在室温条件下保持直到完全凝胶化（水凝胶形成）。通过向加热的溶液中添加羟基磷灰石（CaHa）（1%、5%、10%浓度），制备AgaCaHa复合材料。水与超临界二氧化碳不相溶，凝胶网络中的水相与有机溶剂交换，确保在超临界干燥过程中去除水。超临界干燥的过程较为复杂，详细操作步骤可参考：https://doi.org/10.3390/molecules291124981、 Aga浓度设定为1%，AG1CaHa1（1% CaHa），Aga1CaHa5（5% CaHa），和Aga1CaHa10（10% CaHa）；2、Aga浓度设定为4%，AG4CaHa1（4% CaHa），Aga4CaHa5（5% CaHa），和Aga4CaHa10（10% CaHa）。测量结果证实了前期制备的琼脂糖气凝胶随时间的稳定性， 如下表所示，两组样品在10天后体积小幅减少后，总体上随时间稳定；表2显示了干燥后测量的AgaCaHa复合材料的体积密度和孔隙率。琼脂糖凝胶稳定性
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样品
| 干燥后体积
| 10 天后体积
| 2 月后体积
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Aga1
| 0.7
| 0.62 | 0.61 |
| Aga4 | 0.39 | 0.34 | 0.34 |
| AgaCaha 堆密度、理论密度、孔隙率 |
| 样品 | 堆密度 | 理论密度 | 孔隙率 |
| AG1CaHa1 | 0.069
| 2 | 96.5 |
| AG1CaHa5 | 0.24 | 2.6 | 91 |
| AG1CaHa10 | 0.381
| 2.8 | 86.5 |
| AG4CaHa1 | 0.153 | 1.4 | 88.5 |
| AG4CaHa5 | 0.331 | 2.1 | 84.0 |
| AG4CaHa10 | 0.432 | 2.4 | 82.1
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正如预期，高浓度羟基磷灰石的复合材料，体积密度也增加。就孔隙率而言，复合材料总是比单纯琼脂糖水凝胶孔隙率低。任何浓度的Aga复合凝胶，随着CaHa浓度的增加，孔隙率逐渐降低，即支架中羟基磷灰石浓度越高，其孔隙率越低。红外图谱（FTIR）显示，纯琼脂糖凝胶与一些特征峰相关联，CaHa光谱与科学文献中报告的相似。两种材料的峰都可以在复合光谱中找到。当CaHa和Aga量相当时，两种材料的峰都存在；当CaHa 含量大于Aga时（如Aga4CaHa10），琼脂峰相比羟基磷灰石峰不那么显著（上图）。此外，复合凝胶的FTIR光谱与Aga或CaHa相比没有显示出新的峰。提示得到的是物理混合物，两种材料之间没有形成化学键形成新的物质。比较下面两张扫描电镜图像，发现4% Aga 水凝胶显示出封闭和紧凑的形态。在微米尺度上，1% Aga 水凝胶表现为开放性和典型的纤维状结构，更宽和更圆的孔隙，以及更细的纤维，4%水凝胶则无此结构。这种趋势也可以适用于纳米尺度：纳米孔虽然更加封闭，但在更高的浓度下仍然完整。考虑到BTE应用，纳米结构对于承载羟基磷灰石晶体和促进细胞附着和增殖至关重要。因此，两种结构可能都符合骨组织再生目的。下图为Aga1CaHa1的电镜图，可发现在添加羟基磷灰石后凝胶形态部分受损。当CaHa含量比Aga浓度大一个数量级时，这种效应变得更加显著，主要表现为：1、当CaHa浓度大于1% 时，Aga部分失去其典型形态，特别是在微米尺度上；2、纳米孔虽然远不如纯琼脂糖的开放性，但仍然部分保留。由于这些原因，大量添加CaHa改变了琼脂的结构完整性，但细胞仍可能附着。此外，由于骨骼中富含羟基磷灰石，这种复合材料在纳米尺度上，从化学和结构角度仍可模拟原始组织。这一观点同样可应用于第二组复合材料（即4%浓度Aga凝胶）。下图为Aga4CaHa1样品的电镜图，表现为更类似于纯琼脂糖凝胶，可认为是一个CaHa分散在琼脂糖网格上的体系。此外，更高的羟基磷灰石浓度（即5%和10%），复合凝胶的结构会变得更加封闭和紧凑。能量色散X射线光谱仪（EDX）有助于分析样品的均匀性。Aga1CaHa1、Aga1CaHa5和Aga1CaHa10相关的钙和磷（羟基磷灰石主要成分）的EDX图谱显示羟基磷灰石均匀分布在复合材料截面上，信号强度随 CaHa含量增加而增强，且在微观尺度上均未观察到形成明显的团簇。Aga-CaHa 凝胶的这种均匀分布结构有利于细胞附着、增殖，以及营养物质交换。最后的压缩测试提示，在琼脂糖浓度设定不变的情况下，复合凝胶的机械性能（刚度）随着羟基磷灰石浓度的增加而上升。在压缩测试期间没有任何样品破裂，表现出塑性行为。此外，骨支架应具有约100 kPa的杨氏模量，本次试验中的所有琼脂糖-羟基磷灰石复合凝胶均满足这一要求，可用于BTE。
通过超临界二氧化碳干燥技术成功生产了琼脂糖-羟基磷灰石复合凝胶。EDX和FTIR分析表明，琼脂糖纤维网可有效地承载均匀分散的羟基磷灰石。从机械性能看，Aga-Caha复合材料的杨氏模量数值均超过支架的最低要求，可用于BTE。具体来看，最有希望的候选材料为Aga1CaHa10复合材料，其优势在于高孔隙率（86.5%）和机械阻力（E = 3.5 MPa）之间取得的折衷。这种 A+B 的方式不是第一次出现在我们过往的分析中，自透明质酸广泛地被用于医美整形后，这个材料当仁不让地成为了研发者的首选。但其也具有一定的材料短板，例如吸水性过高、代谢过快等。什么材料可以弥补一些透明质酸的短板，能够为这个市场带来新的开发思路与选择？琼脂糖凝胶与重组胶原水凝胶，正是我们对这个问题作出的一些探索和思考。
制剂开发中，A+B 大部分是简单粗暴的，但往往也会有出人意料的表现。我们选择了 AGA+PLLA、AGA+CaHa、COL+CaHa 汇融全家桶中的成分，却得到了不错的研发成果，无论在骨修复、医美填充中，都创造了优秀的数值与指标。我们也曾异想天开地幻想过，是不是有一天会得到一个终极缝合怪：Cahahacolaga（卡哈哈克拉噶，透明质酸胶原琼脂糖三相羟基磷灰石微球水凝胶）。未来我们会继续分享羟基磷灰石及其在医美、环保、涂料等多个领域的创新应用，以及这类微球作为注射材料的新思考、新灵感。请持续关注Herostem Lab汇融实验室及其下属单位BETAGENE Genetic贝融生物的研发进展。上海汇融细胞科技有限公司（HEROSTEM® LAB，汇融实验室®）位于上海·外高桥自贸壹号生物园，我们于 2012 年成立，致力于细胞与基因工程技术在生命科学与生物美容领域的创新与探索。我们的产品包括了层析填料、工业级生物试剂、医疗美容产品的材料以及制剂品。HEROSTEM®LAB汇融实验室®的重组蛋白工厂已于 2022 年正式投入GMP运营，并获得ISO9001与ISO13485的认证。 更多信息，请查看我们的官网：www.herostem.com.cn
