半胱氨酸定向邻近驱动的天然肽双环化策略
文摘
科学
2024-11-12 08:00
四川
多环肽常见于具有生物活性的天然产物中，如抗生素万古霉素和细胞毒素α-鹅膏素（下图A）。与线性或简单的二硫化物环化肽相比，化学多环肽具有更大的构象刚性和代谢稳定性。重要的是，处于小分子药物和生物制品之间的化学空间中，多环肽被认为是药物发现的一种非常有吸引力的方式。特别是，它们已被证明在抑制蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）方面表现出很高的效力，而合成小分子在PPIs中则被认为是不可成药分子。然而，发现具有所需生物活性的多环肽仍然很困难，至少部分原因是它们的合成挑战，这阻碍了容易获得用于肽库筛选的各种多环肽。因此，天然肽的双环化方法仍然是很需要被开发的。本期小编就给大家介绍一种半胱氨酸导向的邻近驱动策略，用于从简单的天然肽前体构建双环肽。这种线性到双环化的转化始于快速半胱氨酸标记，然后触发邻近驱动的胺选择性环化。这种双环化在生理条件下快速进行，产生具有Cys-Lys-Cys、Lys-Cys-Lys或N-末端-Cys-Cys缝合模式的双环肽。作者设计了一组三官能交联剂3a、3b和3c，它们安装了快速半胱氨酸反应性双氯肟（BC）基序和用于胺偶联的活化酯（下图A）。为了进行比较，我们还合成了分别带有二溴甲基苯（DBB）和1,3-二氯丙酮（DCA）基序的3d和3e。DBB和DCA通常用于半胱氨酸偶联，然而，与氯肟试剂相比，它们显示出缓慢的反应动力学。此外，还制备了具有单一氯肟基序和两种活性酯的交联剂3h。所涉及的硫醇和胺交联反应都可以在生理条件下在天然肽中进行。如预期的那样，所有的含双氯肟的交联剂（3a、3b和3c）通过Cys-Lys-Cys缝合顺利地产生双环产物2a。其中，3a与四氟苯酚酯（TFP）和3b与N-琥珀酰亚胺酯（NHS或OSu）以相同的效率工作，在10分钟内产生几乎完全转化的双环肽2a。含有慢半胱氨酸标记手柄的活化酯3d和3e未能产生大量的双环产物[下图B，等式（2）和（3）]。相反，它们引发了低转化率，或者产生了带有完整烷基卤化物的单环肽作为主要产物（下图C）。除了Cys-Lys-Cys-缝合，当使用交联剂3h时，还实现了肽P17的Lys-Lys-Lys缝合，以94%的转化率得到双环7a（下图D，E）。双环化对含半胱氨酸/胺的残基（赖氨酸或N末端）显示出比其他内源性氨基酸残基更高的特异性，如色氨酸（2a）、丝氨酸（4b）、酪氨酸（4b）、谷氨酰胺（4F）和谷氨酸（4d）（下图A）。组氨酸残基通常被认为比赖氨酸残基对活化酯更具反应性，但在我们的双环化方案中似乎也能耐受（4e，4f）。通过活化的酯-组氨酸偶联形成的酰基咪唑中间体可能进一步与附近的赖氨酸-胺反应，产生稳定的赖氨酰双环化产物，如4e的缓慢形成所示。从拓扑上讲，侧链双环肽结构分别通过内赖氨酸-赖氨酸-Cys-半胱氨酸-半胱氨酸-葡萄糖苷（下图A）和外赖氨酸-Lys-Cys-丝氨酸-葡萄糖苷结合（下图B）构建。修饰残基之间的间隔氨基酸的数量[m，n]可以在0到9之间变化，提供了广泛的结构多样的大环肽。令人惊讶的是，我们能够获得具有零间隔区氨基酸（[m, n]=[0, 0]）的高度限制的双环三肽4g，其仅涉及双环核心结构中的三个氨基酸。考虑到其刚性几何形状和疏水性，这种小尺寸的双环三肽可能具有独特的性质。
通过N-末端-Cys-Cys从带有游离N-末端的天然肽（如Gly（5a）、Ala（5b–d），甚至空间位阻Pro（5e）中缝合制备涉及主链的双环产物（5 a–5g）（下图C）。重要的是，该双环化方案对三（2-羧乙基）膦（TCEP）具有良好的耐受性：二硫化物环化肽可以很容易地通过TCEP还原来断裂，然后在没有纯化的情况下进行双环化，以高产率得到所需的双环产物（下图D）。最后，不出所料，使用我们的方案双环化的肽在不同pH的水性介质中表现出强大的化学稳定性。为了检查我们的双环化方案的位点特异性，我们对蛋白质融合肽进行了双环化（下图）。具体而言，我们设计并表达了一种葡萄球菌超抗原样蛋白11（SSL11）蛋白，该蛋白将模型肽（GGCA4KA4CWGGG）融合到其C末端，并在其C末端与烟草蚀刻病毒（TEV）切割位点（ENLYFQ/G）融合。融合蛋白还携带N-末端His标签以促进纯化。除了模型肽尾部的赖氨酸残基外，该融合SSL11蛋白还具有22个表面暴露的赖氨酸残基和一个游离的N末端（组氨酸），这可能是用于标记的竞争性亲核试剂。用TCEP还原二硫化物后，将融合SSL11蛋白6a与2当量的交联剂3b在温和条件下（PBS中的8%丙酮，pH 7.4，室温）孵育（下图A）。通过LC-MS分析监测反应进展。孵育15分钟后蛋白质6a就被完全消耗。该方法在天然肽双环化方面非常新颖，显示出非常好的选择性和反应性，大家在遇到多肽修饰时，大可尝试，极有可能得到一些新的双环化多肽药物。
