肽和蛋白质在基本生命过程中表现出的广泛功能表明了其化学制备的重要性。从生物学角度来看，它们作为治疗剂和生化工具具有至关重要的意义，FDA最近批准的治疗肽和蛋白质就是明证。尽管多肽合成方案取得了重大进展，但现有的方法依赖于连接多肽的两个基本原则：前修饰末端残基（例如−COOH到−COSR）和侧链保护基（例如，−tBu）。这些先决条件引入了在连接位点或保护基结合人工残基的额外步骤，导致了复杂和劳动密集的过程。由于缺乏容纳所有20种蛋白质生成氨基酸的化学选择性化学方法，在连接位点直接连接未修饰的肽基N-和C-末端面临着重大挑战。如下图所示，未受保护的蛋白质生成肽的分化构成了一个重大障碍，并且通过分子间（细长肽）或分子内方法（环化肽）连接线性肽在化学上仍然无法实现。挑战包括辨别不同蛋白质生成氨基酸侧链之间的反应性变化，以及维持连接位点的原始立体化学。此外，未受保护的肽的固有极性限制了它们在许多溶剂中的溶解度，通常有利于水溶液。然而，利用水溶液通过抑制水的必要形成来阻碍肽连接，水是肽酰酰胺化平衡的副产物。
本期小编就给大家介绍一种连续的化学选择性激活方案，在不依赖残基预修饰或正交保护的情况下实现分子内肽连接。
大多数肽基侧链和末端都是亲核的，当所有蛋白质残基中最亲核的部分选择性地与亲电试剂（激活剂）结合时，可能会发生化学分化。在天然肽环化（NPC）中，关键的选择性是将C末端指定为主要亲核残基。注意的是，pH依赖性的两性离子会影响残基的亲核性，NPC调节反应pH以使侧链和末端亲核性稳定，从而优先激活C末端和N末端，最终实现线性肽环化。在接近中性至高pH水平（7−12）时，半胱氨酸硫代物离子比其他残基更亲核（在pH 10−12时为10000倍）。同时，氨基侧链、N-末端和C-末端羧酸根离子表现出相当水平的亲核性，使其无法区分（下图左）。相反，在低pH水平（2−5）下，大多数残基基于其pKa和等电点值而被质子化，并且与C-羧酸根离子的亲核性（COO−/COOH平衡）相比，半胱氨酸巯基（−SH）和质子化胺（NH3+）的亲核能力显著降低。因此，在低pH（2−5）下，羧酸根离子成为两性离子肽中最亲核的成分，紧随其后的是硫醇部分。这些有机的亲核性可以用于化学选择性反应。
理论上讲（上图右），将未受保护的肽与N-末端半胱氨酸浸入pH～3的缓冲液中，会导致C-末端（COO−）成为肽最亲核的实体。反应性C末端优先与亲电活化剂（异腈）结合，形成混合酸酐加合物，从而实现C末端活化。活化的C-末端基团随后通过分子内硫解被N-末端半胱氨酸巯基（SH）捕获，导致化学选择性形成硫内酯。NPC以动力学控制的N到S移位结束，从而形成稳定的肽酰胺键，实现环化。
以五肽Cys-Trp-Asn-Tyr-Ala（CWNYA三氟乙酸和TFA盐）用于初始化学选择性NPC研究（下图）。在38°C下，用pH7.8的异丙腈磷酸盐缓冲液（PBS）处理CWNYA，导致N-末端完全硫化，通过硫代甲酸酯中间体形成CWNYA-N-甲酸二酰胺。PBS溶液的pH降低导致同时形成所需的环状CWNYA和CWNYA-N-甲二酰胺（如插入表所示）。值得注意的是，通过将PBS溶液的pH降低到其较慢的阈值（NaH2PO4，pH=4.7），环-CWNYA的产率增加到30%，表明pH对所需环化的选择性有明显的影响。将反应pH降低到4以下是一个挑战。采用几种已建立的缓冲体系，如柠檬酸/Na2-HPO4和NaOAc/HOAc，它们含有相互竞争的羧酸，导致了复杂而无效的结果。在接近2的pH下没有观察到与NaH2PO4/H3PO4缓冲液的反应。有趣的是，将线性肽CWNYA（TFA盐）溶解在纯H2O中产生酸性溶液（pH＝3.2），并得到了最佳结果（73%环-CWNYA）。在环境温度下形成硫内酯基序（46%产率），验证了所提出的硫解作用。
环化肽底物范围：接下来，作者研究了环化35种来源于未修饰前体肽的NPC选择性和兼容性（下图）。半胱氨酸或N-甲基半胱氨酸残基必须位于所有线性前体的N-末端，而其他位置则由随机选择的蛋白质残基、D-氨基酸残基和非经典残基填充。NPC方法显示出显著的兼容性，有效地实现了半胱氨酸/N-甲基半胱氨酸与不同C末端残基之间的环闭合。由于限制，不能形成蛋白质原性四环肽，而实现了与非规范残基（3a-3n）的四肽环化。NPC有效地环化了5至20个氨基酸残基的肽（3o-3x），其中最长的环肽为20个残基（3z，74%的产率），显示了NPC在更大的大环合成中的潜力。保留残基立体中心对于有效连接至关重要。作者评估了NPC诱导的差向异构化的潜力，表明在环化样品中没有明显的外消旋作用。制备了五对线性肽序列，结合了已知具有潜在C端差向异构作用的L-或D-氨基酸（下图方框）。半胱氨酸与L-丝氨酸（3-L-a）、L-缬氨酸（3-L-b）、D-丝氨酸（3-D-a）、D-缬氨酸（3-D b）、L-酪氨酸（3-L-e）和D-酪氨酸（3-D-e）之间的连接提供了单一异构体。然而，在L-和D-苯丙氨酸C-末端的缩合导致了不同程度的差向异构化，外消旋率在0.2%至9.7%之间。总之，这些结果表明，NPC过程在环闭合过程中具有很高的效率，差向异构化最小。
为了区分天冬氨酸和谷氨酸的C-末端和侧链的羧酸基团之间的选择性。这些羧酸根残基的α-、β-和γ-羧酸根各不相同，pK值分别为1.9−2.2、3.7和4.2。在NPC条件下（pH～3），与β-和γ羧酸盐相比，α-羧酸盐表现出最高比例的去质子化形式（COO−），表现出显著的亲核性。因此，在初始异腈活化过程中，C-末端羧酸根离子最有可能是官能化的残基，超过了Asp和Glu侧链反应性。为了验证这一假设，评估了五个专门设计的类似物序列，即Cys-Phe-C蛋白酶-X（X=Gly（4a）、β-丙氨酸（4b）、GABA（4c）、Asp（4d）和Glu（4e））（下图）。4a的环化以优异的产率得到环化产物5a（α-羧酸盐，87%，6h）。相比之下，4b（β-羧酸盐）的环化需要更长的时间（12h），并导致较低的产率（51%）。4c（γ-羧酸盐）的环化在24小时后产率低（<5%）。在NPC条件下（α，6小时，87%；β，12小时，51%；γ，24小时，<5%），羧酸盐之间观察到的不同反应速率和产率表明，C-末端羧酸盐比Asp和Glu侧链更亲核。
肽序列中的α-和γ-羧酸盐的竞争性实验：Cys-Phe-Caprocid-Glu（4e）的环化主要在6小时内产生α-羧酸盐环化产物5e（53%），而γ-羧酸酯缩合产生7，产率仅为5%。在更复杂的系统中观察到C-末端α-羧酸盐的高选择性，将一系列线性肽（8a-8g）置于NPC条件下（下图），并评估两种可能的大环，C-末端环化产物（9a-9g）和Asp/Glu侧链酰胺化部分（10a-10g）的比例。含有Glu的多肽（9a-9c）的胺化反应显示出一致的化学选择性，导致排他性的C末端缩合。当Glu位于C末端时，选择性保持不变，仅得到产物9d（40%）。与β-羧酸盐（Asp）相比，在含有Asp的肽中观察到的主要结果是C末端环化，八聚体9e在C末端的α-羧酸盐处显示出选择性环化。环肽9f和10f的C-末端酰胺和Asp侧链酰胺的比例分别为8:1。在含有Glu和Asp的肽中，N末端优先与丙氨酸（9g）和Asp侧链（10g）以1.7比1的比例反应，而Glu侧链保持完整。然而，当将Asp置于肽C末端时，Cys-Phe-Caprocid-Asp（4d）的环化在延长反应时间（60小时，25%转化率）后导致转化率低，并且在α-和β-羧酸盐之间没有明确的选择性。观察到异构体5d和6之间的比例接近于1:1。
NPC是一种只利用挥发性异腈的清洁方法，可以进行原位转化（下图）。通过还原将粗环CWNYA转化为不含半胱氨酸的环肽20，或进行原位S-烷基化以将各种部分（例如苄基，21）引入环状支架中。粗环CWNYA和21的HPLC显示可接受的产物纯度。
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