上一期给大家介绍了百时美施贵宝---“大环硫醚肽BMS-98618960” 的60克合成和纯化，太赞！多个N-甲基化的非天然氨基酸由于肽在全局侧链脱保护和沉淀步骤中易裂解而给制造带来了挑战。这些问题在放大时加剧，导致产量严重下降。本期小编继续给大家介绍大环肽BMS-986189的800克合成工艺开发，杂质分析，纯化方法等。最终以DIC/Oxyma化学偶联方法（总产率10.74%）从3.2mol规模的合成中制造了约800克98.1%纯度的API。
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在本案例中，首个氨基酸，即带有Fmoc保护的甘氨酸，被加载到Rink酰胺MBHA树脂上，选择这种树脂是为了得到C末端的肽酰胺。每个连续的氨基酸偶联之前都进行了基础介导的去保护步骤，以去除Fmoc基团。在Fmoc氨基酸残基偶联到暴露的氨基上之后，采用了一种封端策略，以防止残基缺失杂质进一步反应。难以与即将到来的氨基酸残基偶联的游离氨基通过与过量的乙酸酐反应被乙酰化。这种封端产生了更小的、被截短的乙酰化肽，这些肽比未封端的缺失杂质更容易清除。对于目标肽，在经过16轮迭代的Fmoc去保护、氨基酸偶联和封端之后，得到了连接在树脂上的线性肽。最终偶联安装了N末端的氯乙酰酰胺，这是大环化的亲电手柄，得到了树脂上的化合物2。通过酸介导的全局去保护步骤，从树脂上裂解出侧链未保护的线性肽3。肽被分离为固体双TFA盐，并随后溶解在高pH缓冲液（pH 8-9）中。这确保了在核苷酸硫醇和N末端氯乙酰酰胺之间通过SN2型取代发生大环化，生成化合物1（方案1）。表1总结了初始和修改后的偶联条件。最初的合成改进工作集中在优化单次偶联条件，以消除对双次偶联的需求，并减少所需的封端步骤数量。作者的目标是在减少成本和环境污染的同时提高产品纯度。为了实现这一目标，了解产率损失和质量平衡的来源，并通过工艺的过程理解来理解这一点至关重要。通过反相分析HPLC分离杂质，并使用高分辨率质谱分析每个峰，仔细评估了初始合成的粗产品。通过这种方式，检测到了四个主要的封端杂质，这些杂质暴露了氨基酸残基3、6、10和11的困难偶联。这些偶联需要重复的酰胺化循环才能实现可行的过程，通过在需要时实施更长的反应时间来改进。最初的优化保留了HATU作为偶联试剂，因为它提供了快速的偶联和最小的消旋。在大量的肽偶联试剂中，选择HATU/DIPEA条件在早期阶段构建肽方面表现良好。然而，HATU 基于热稳定性数据，是大规模制造过程中最不受欢迎的偶联试剂之一。此外，与更安全的替代品如二异丙基碳二亚胺（DIC）等羰基二亚胺类试剂相比，HATU 的价格更高。DIC 有一个额外的优势，即不需要添加有机碱，从而最小化了消旋化的风险，尽管需要添加剂（例如，氰乙酸羟胺酯（Oxyma）、1-羟基苯三唑（HOBt））和羧酸的预激活。Oxyma 被认为会产生氢氰酸，通过适当的试剂添加序列和工程控制，在偶联期间降低了工人安全的风。最近有报道称，在使用 Oxyma 期间有额外的 HCN 安全解决方案。表2总结了基于 HATU 和 DIC/Oxyma 的关键比较。在优化固相偶联序列之后，对粗肽的液相色谱-质谱（LC-MS）分析显示，大多数杂质是在全局脱保护和肽沉淀步骤期间形成的。图2突出显示了一个典型的粗肽色谱图，并标记了与从 MTBE 沉淀过程中的脱保护和沉淀相关的各种不希望的修饰点。早期使用标准裂解混合物（由三氟乙酸（TFA）、苯酚、三异丙基硅烷（TIPS）和水组成）进行脱保护研究表明，在 N-甲基化残基的羰基处导致了明显的水解（图2，杂质 A-C）。已有报道称，在肽中，TFA介导的 N-甲基化氨基酸残基的水解。用 TFA、TIPS 和二硫苏糖醇（DTT）在无水条件下制备的改良裂解和脱保护溶液，通过减少水解，改善了纯度概况。据推测，在 C 末端氨基酸处形成的五元含氧杂环酮类中间体有助于在 N-甲基残基处的水解（方案2）。这种机制得到了观察到的由水解和甲氧基化片段产生的对映异构体的支持，因为 N-甲基化氨基酸在含氧杂环酮中的α-立体中心极易发生表观异构化。参与的氧的电荷密度、肽中烷基侧链的整体空间相互作用以及稳定形成含氧杂环酮的诱导效应，都有助于提高肽水解的速率。表3列出了在粗肽中观察到的各种杂质。在全局脱保护期间，由于叔丁基阳离子或在TFA介导的N-Boc氨基甲酸酯、叔丁基醚和叔丁基酯保护基团裂解期间形成的叔丁基三氟乙酸酯的不足淬灭，观察到几个与叔丁基加合物（M + 56 Da）相关的杂质。多个残基在苛刻的脱保护条件下容易形成叔丁基加合物。色氨酸的吲哚侧链容易受到亲电取代，导致叔丁基加合物的混合物。半胱氨酸的硫醇基团也报道过能够生成对标准TFA脱保护有抵抗力的叔丁基硫醚。水是淬灭叔丁基阳离子的良好清除剂；然而，对于这个目标，水必须从裂解混合物中排除，以防止如前所述的肽水解。乙二硫醇（EDT）和三异丙基硅烷（TIPS）添加剂最小化了叔丁基加合物形成的程度。使用MTBE进行肽沉淀是额外杂质的来源。MTBE在裂解混合物的酸性条件下特别是高温下，容易产生甲醇，导致肽的甲氧基化。此外，还观察到了一个Δ1−2缺失杂质，由二酮哌嗪（DKP）机制生成（方案3）。DKP的形成在固相肽合成中普遍存在，主要在树脂上带有游离胺时，以及在存储期间导致N末端二肽的缺失。已知酰胺键在两个连续氨基酸之间的顺式构象有利于DKP的形成。这种顺式构象在N-甲基化氨基酸残基存在时是有利的，并且从N-末端开始的第二个氨基酸是N-Me-Ala，大大增加了DKP形成的倾向。作者观察到DKP介导的Δ1−2缺失杂质的存在，即AA[3−15]肽（方案3）。已有关于DKP形成的详细机理研究和各种有利于DKP的因素以及最小化DKP的控制措施的报道。对于目前的肽，最小化最终Fmoc脱保护和氯乙酸酯偶联之间的保持时间足以控制这种杂质水平。接下来，专注于在规模上改进粗肽的沉淀。最初，肽是通过添加乙醚（Et2O）来沉淀的。虽然这是沉淀肽的良好物理性质的标准反溶剂选择，但Et2O因其容易形成过氧化物而具有潜在的爆炸危险性，以及其低闪点而臭名昭著。使用Et2O在大规模上存在的内在安全风险促使团队寻找替代的反溶剂（"Antisolvants" 是指那些可以促进溶解在溶剂中的溶质（如肽或蛋白质）沉淀出来的物质。）。叔丁基甲醚（MTBE）和环戊基甲醚（CPME）作为具有比Et2O更低过氧化物形成能力和更好安全特性的醚类溶剂脱颖而出。MTBE最终因其改善的物理性质和沉淀目标肽的快速过滤而被选中。尽管CPME考虑到其闪点和沸点是一个很好的选择，但由于其高成本和低自燃点，需要特殊的反应器来处理，因此CPME不如MTBE受欢迎。使用MTBE的一个缺点是它对酸性水解不稳定，这会在全局脱保护期间导致叔丁基化杂质的形成。其他追踪到MTBE酸性水解产生的甲醇的杂质对应于在相同残基上容易发生水解的甲氧基化，导致甲酯的形成。令人欣慰的是，通过在低温下进行大规模裂解和沉淀，显著抑制了水解和甲氧基化，这需要缓慢地向裂解混合物中添加MTBE以抵消放热的反溶剂副反应。表4比较了围绕全局脱保护和沉淀步骤的过程改进。更高水平的TIPS有助于淬灭全局脱保护中生成的阳离子，减少粗线性肽中的加合物水平。![]()
BMS-986189的大环化涉及半胱氨酸对氯乙酸酯基团的分子内SN2型取代。最初的程序使用的是从裂解混合物中用乙醚（Et2O）反溶剂沉淀的粗线性肽，通过离心分离，并在pH值调整到8.0-8.5进行环化，使用的是碳酸铵或醋酸铵。在规模上使用碳酸盐或碳酸氢盐缓冲液涉及到安全风险，特别是在高容量过程中，如分子内大环化，可能会产生气体释放；因此，需要一个替代的缓冲系统。考虑了几种缓冲液，如醋酸铵以及各种磷酸盐缓冲液，最终选择了醋酸铵，因为它在最终冻干过程中容易去除残留的盐。此外，还探索了反应溶剂系统和浓度，以找到使用10 mg/mL肽溶液（约5.2 mM）在95:5 MeOH:4 M NH4OAc，pH 8.0下的最佳产量。为了改进原始程序并确保一个可扩展且稳健的环化过程，作者研究了缓冲液组成、pH值和底物浓度的影响。对于半胱氨酸硫醇对氯乙酸酯的分子内取代，作者预期在碱性条件下会有速率提升。为了在规模上优化过程，研究了在不同pH值的磷酸盐缓冲液中的反应转化率，并计算了半衰期。由于硫代阴离子与硫醇相比具有更高的亲核性，更高的pH值导致了环化速率的增加，因此选择了pH 8.0。在早期阶段，为了确保分子内与分子间环化的有利比例，从而有利于不希望的二聚体/低聚体物种，维持了高稀释度（100 V或10 mg/mL浓度，假设基于初始树脂装载的100%产率计算；注意“V”指每克底物的溶剂体积毫升数）。对在不同浓度范围（10-100 mg/mL，相对于线性肽的干重）进行的环化反应的粗肽纯度进行的研究表明，增加的浓度与降低的纯度和更高水平的二聚体和低聚体相关（见图4）。因此，倾向于使用10-20 mg/mL的较低浓度，以提高BMS-986189的产量，尽管牺牲了体积效率。对于生产，采用了15 ± 1 mg/mL的浓度（相对于粗线性肽）。为了在规模上简化过程，作者寻求消除在环化反应液中通过NaOH添加所需的繁琐的pH调整。此外，还评估了在无水条件下促进大环化的替代碱，并在色谱阶段提供更大的灵活性。由于甲醇溶剂对粗肽的高溶解度和甲醇溶液适用于色谱纯化，因此选择了甲醇作为首选溶剂。测试了各种有机碱，并发现它们能够快速形成产品（见表5）。最终选择了氨，因为它与反相色谱兼容，易于去除，并且作为甲醇溶液商业上可获得。与早期的环化条件类似，肽浓度维持在10 mg/mL，以最小化二聚体和低聚体的形成。重要的是，观察到环化反应液在室温下稳定长达1个月，这对于适应生成粗肽和通过色谱纯化之间的潜在保存时间至关重要。大环化反应液通过制备性反相色谱纯化。采用了两阶段的纯化策略。首先，将粗环化反应液加载到一个制备性反相柱上，并通过应用稀水溶性TFA和乙腈的梯度进行洗脱。满足过程控制（IPC）标准的部分纯品液被合并，并进行第二次反相纯化。在这种情况下，第一次色谱的合并溶液被重新加载到柱上，依次用NH4OAc和乙腈进行洗涤，并使用水溶性AcOH和乙腈进行洗脱。最后，合并和冻干，以>98%的纯度得到了双醋酸盐的API。这提供了一种替代超临界流体色谱（SFC）纯化的方法，而SFC并不是所有肽制造设施都可用的。结论：通过使用DIC/Oxyma化学偶联方法（总产率10.74%）从3.2mol规模的合成中制造了约800克98.1%纯度的API。
