环肽类药物近年来因其独特的属性和潜在的治疗应用而受到极大关注。与线性肽相比，环化带来的刚性可以将肽锁定在受目标结合所青睐的构象中，并增加稳定性和抗蛋白酶介导的降解能力。已经积极探索了各种策略来发展肽环化。在目前市场上的肽类药物中，最常见的环肽是二硫键环肽（目前已有23种），包括催产素和抗利尿激素类型、生长抑素类型、心血管类型等。然而，天然的二硫键容易在细胞的还原环境中被还原，可能影响药物的活性和稳定性。为了克服天然二硫键的内在缺陷，一些二硫键重新桥接的策略也已出现，作为二硫键模拟物以提高代谢和物理稳定性。最近开发的二硫键修饰策略包括使用非天然氨基酸、构象限制残基和生物等电子替代物。另外，直接修改现有二硫键环肽的双半胱氨酸交联策略也已被探索。在这种情况下，基于双亲电试剂的对称交联剂，包括双卤化物连接剂、1,3-二氯丙酮（DCA）、马来酰亚胺类似物、溴吡啶二酮类似物、双钯连接剂、全氟二苯醚、双高碘连接剂和双氧化二唑基甲基磺酮（DiPODS）等已被开发，通过S-烷基化或S-芳基化实现二硫键桥接。此外，双烯烃和双炔烃也被用于S−S环化的多样化。这些方法更适合于生成被束缚的肽结构而不是二硫键模拟物，因为形成的连接体积庞大，并且大环尺寸有显著偏差。图片来源：Org. Lett. 相比之下，引入一个碳链连接物提供了一个接近二硫键模拟物，并将环尺寸偏差最小化。2016年，Cramer和Kourra使用CH2I2试剂与双半胱氨酸肽反应形成甲硫基缩醛，这消除了二硫基团的还原性负债并增强了结构稳定性。2020年，Loh等人开发了一个类似的过程，其中α,α-二氯丙酮试剂带有功能性载荷，通过与两个硫醇基团的双重亲核取代反应生成甲硫基缩醛连接物。最近，Poulsen等人报告了一种oxSTEF试剂，它通过双重硫醇交换生成双硫酮缩醛连接的产物，而Fang等人开发了一种重氮盐试剂，直接从二硫键通过光诱导的自由基过程生成甲硫基缩醛桥接肽。上述所有方法都是在水性缓冲系统中进行的，这需要肽具有良好水溶性。不幸的是，当使用疏水性或聚集倾向的肽作为底物时，这一要求可能无法满足。此外，在Loh和Fang的情况下，在甲硫基碳上生成一个新的手性中心没有立体选择性，或在Poulsen的情况下产生E/Z异构体混合物，导致产物的不均匀性，可能会影响生物评估。因此开发出没有序列偏见和产品结构异质性的稳健的单碳双半胱氨酸重新桥接方法对于生物活性肽环化是非常有趣的。图片来源：Org. Lett. 本期小编将给大家介绍香港大学化学系李学臣教授发展的一种在三氟乙酸（TFA）中通过与酮类进行硫代缩酮化来形成二硫键模拟物的新型环化方法。这种方法的特点是高化学选择性、操作简单和稳健。并且TFA作为反应溶剂可以溶解任何未保护的肽。（Org. Lett. 2024, 26, 6512−6517）作者注意到，在TFA条件下，含单半胱氨酸和双半胱氨酸的肽能与苯甲醛有效反应，分别形成相应的分子间和分子内硫代缩酮衍生物，在后一种情况下观察到非对映异构体混合物。这一观察结果非常鼓舞人心，因为TFA可以被视为未保护肽的“通用”溶剂。因此，探索使用对称环酮作为交联剂来生成二硫键模拟物，以消除产品异质性。选择对称环酮是基于以下考虑：(1)避免产生非对映异构体；(2)利用环张力能量增加酮的反应性（图1C）。图片来源：Org. Lett. 首先，在TFA作为唯一溶剂的条件下，用肽1a和9-氟代芴(cK-I)进行了模型反应。期望的硫代缩酮产物2a以高化学选择性和转化率（92%，表S1，条目4）在常温下8小时内得到。包括乙腈（ACN）、2,2,2-三氟乙醇（TFE）和六氟异丙醇（HFIP）在内的其他有机溶剂作为共溶剂对反应没有帮助。预计TFA不仅作为溶解肽的溶剂，还作为质子酸催化剂激活环酮，实现有效的硫代缩酮化。13C NMR分析清楚地显示了硫代缩酮季碳在61.32 ppm的信号。图片来源：Org. Lett. 有了最佳条件，接下来探索了适用范围和局限性。一系列随机序列的肽（1b−1g）和治疗性二硫键肽药物（例如，加压素、特利加压素、setmelanotide、lanreotide和催产素）被合成并用这种硫代缩酮化方法进行了测试（表1）。无论肽序列、氨基酸组成以及双半胱氨酸之间的间隔长度如何，它们都在标准反应条件下与cK-I顺利反应。值得注意的是，催产素中的N-末端半胱氨酸也得到了耐受。接下来，评估了其他对称环酮，包括环丁酮(cK-II)、环戊酮、二氢黄酮、9(10H)-二氢吖啶和哌啶二酮(cK-III, cK-IV 和 cK-V)。环丁酮(cK-II)与肽1a顺利反应，以91%的转化率得到2h，而环戊酮和环己酮分别只显示了30%和47%的转化率，这是由于它们的反应性低得多。当使用商业化的1-Boc-4-哌啶二酮(cK-III)时，以20%的产率分离出了去除了Boc基团的环硫代缩酮产物。除了期望的产物2i外，还观察到了由另一个哌啶二酮分子加成产生的叔丁基取代胺副产物和过度反应副产物。因此，合成了带有炔基(cK-IV)或叠氮基(cK-V)的哌啶二酮衍生物，它们可以通过点击化学进一步官能化，以用于后续的生物应用。肽1a、terlipressin和bactenecin顺利转化为相应的硫代缩酮产物(2j−2m)，无论是使用cK-IV还是cK-V，都获得了良好的HPLC分离产率。 图片来源：Org. Lett. 由于建立了TFA介导的无添加剂肽硫代缩酮化与环酮的反应，作者继续考虑将丙酮作为这种反应的最小酮单元。与具有张力的环酮相比，预计丙酮对硫代缩酮化的活性要低得多。的确，正如预期的那样，在上述条件下肽1a和丙酮的反应中，通过UPLC分析没有检测到期望的硫代缩酮环产物3a（表S2，条目1）。令人惊讶的是，当将丙酮和TFA的比例增加到1:1时，肽1a在8小时内完全转化（表S2，条目4），以高产率（94%转化率）干净地得到3a。这一结果非常令人兴奋，因为二甲基硫代缩酮结构可能作为二硫键的最佳模拟物。 图片来源：Org. Lett. 因此，一系列治疗肽，包括terlipressin、setmelanotide、lanreotide、octreotide、DOTA-TATE、生长抑素、eptifibatide和moxitorfortide，在标准条件下用丙酮进行了后期硫代缩酮化测试（图2）。令人高兴的是，所有这些例子都几乎实现了定量转化。值得注意的是，含有多个亲核侧链（Lys、Trp、Thr、Ser和游离N-末端）的生长抑素与反应条件完全兼容，产率为51%（3d）。DOTA-TATE，一种带有放射性核素螯合剂（DOTA）的生长抑素受体放射性核素治疗（PRRT）激动剂，也顺利转化为硫代缩酮版本，产率为77%（3f）。图片来源：Org. Lett. 扩展应用带有炔基功能的硫代缩酮二硫键模拟产物2j进一步进行了铜催化的叠氮-炔烃环加成（CuAAC）反应，以安装荧光团形成2l（图3A）。此外，这种TFA介导的硫代缩酮化方法很容易放大，因为用“TFA混合物”从树脂中裂解的粗肽可以直接用于环化，其中全局肽去保护残留的试剂不会影响反应。在这种情况下，从Rink Amide树脂裂解的粗terlipressin（载荷0.55 mmol/g）和全局去保护在0.1 mmol规模上与9-氟代芴（20当量）反应，得到55.6毫克的环状产物2d，产率为40%（图3A），从固相肽合成得到的粗setmelanotide与丙酮反应，得到104.2毫克的环状产物2e（图3B）。图片来源：Org. Lett. 硫代缩酮环肽的生物活性和稳定性研究表明，从lanreotide（LAN）和octreotide（OCT）得到的硫代缩酮环状模拟物LAN-ACE 3d和OCT-ACE 3e在GSH（100倍）条件下的稳定性大大提高。它们在120小时后几乎保持不变，而几乎一半的lanreotide和octreotide在相同条件下被降解（图4A）。pH变化也不影响它们的稳定性。为了评估修饰对生物活性的影响，使用LAN-ACE 3d和OCT-ACE 3e测量了与SSTR2的特异性放射配体结合亲和力，并与lanreotide和octreotide进行了比较。从下图B可以看出，尽管LAN-ACE 3d和OCT-ACE 3e与lanreotide和octreotide相比，SSTR2的结合亲和力有所降低，但它们仍然保留了生物活性，IC50在个位数纳摩尔范围内（5.04纳摩尔和1.80纳摩尔）。考虑到大大提高的稳定性，LAN-ACE 3d和OCT-ACE 3e显示出作为癌症治疗改进版本的潜力。图片来源：Org. Lett. 总之，该策略一种稳健的后期环化方法，可以从合成的双半胱氨酸肽或含有二硫键的商业肽治疗剂中形成硫代缩酮环肽。该方案使用对称环酮和丙酮作为现成的交联剂，TFA作为反应介质和催化剂。反应表现出高化学选择性，耐受任何氨基酸。它的特点是操作简单和稳健性。特别是，使用TFA作为反应溶剂和丙酮作为交联剂非常有利，因为TFA是未保护肽的通用溶剂，丙酮是任何实验室中常见的溶剂。可以预见，二甲基硫代缩酮连接物作为环肽中二硫键的良好模拟物，具有增强的稳定性。这种方法为生成稳定环肽提供了一个有希望的选择，以探索活性和结构之间的关系。
