肽是近几十年来被广泛研究的极具前景的生物活性分子，作为重要的潜在治疗药物和生物材料、化学生物学探针以及靶向治疗平台。然而，与学术界的蓬勃发展形成鲜明对比的是，天然的肽常常因为固有的局限性，例如较差的蛋白酶稳定性和低的膜渗透性，阻碍了它们作为临床药物的进一步应用和转化，这些问题可以通过引入结构修饰和环化来缓解。此外，将亲电“弹头”引入肽中，使其能够与目标共价结合，可以进一步提高其效力，这一点已经通过蛋白酶体抑制剂carfilzomib的成功得到证明。在这种情况下，肽的化学操作一直迫切需求，并已成为结构合理排列肽的主要工具，从而为后期肽生物偶联和修饰提供了一系列的手段。尽管取得了丰硕的进展，但化学界仍然高度渴望开发肽后期化学修饰的替代方法。色氨酸（Trp）是天然蛋白质中含量最稀少的氨基酸，仅占约1%，但存在于大约90%的蛋白质中，是肽和蛋白质修饰的理想位点。特别是Trp的侧链带有独特的吲哚环，由于其可变的化学活性，在后期修饰中展现出巨大的潜力。因此，已经开发并应用了多种利用Trp修饰的方法（方案1a）。以过去3年为例，过渡金属催化的C-H活化为肽的后期修饰提供了良好的化学选择性，已被几个小组研究。然而，报道的方法需要苛刻的反应条件，例如高温、氧化剂添加剂、辅助导向基团和复杂的反应条件，这限制了它们在生物活性肽研究中的应用前景。随着近年来光化学的发展，通过自由基介导的C2位胺化、氟烷基化、烷基化和硫代反应已经在Trp的吲哚环上进行了探索，用于肽的官能化。相比之下，由于Trp吲哚环上的NH位点的亲核性和碱性较低，因此在Trp的NH位点上的修饰较少被探索。本期小编就给大家介绍一种通过有机催化实现含色氨酸肽的后期功能化的实用而高效策略（DOI: 10.1039/D4SC01244E）。这是首次使用MBH碳酸酯作为反应对应物，在色氨酸残基的吲哚NH位点上对肽进行各种丙烯酸酯取代基的烯丙基化，也是第一个例子。该策略应用广泛，可以将包括荧光团、脂质、亲水标签、糖类和天然产物在内的各种功能分子整合到肽中。重要的是，这种烯丙基化能够在温和条件下通过分子内环化和分子间订书钉化实现环肽的构建。此外，该反应还允许在固相肽合成（SPPS）的树脂上进行肽烯丙基化，从而获得结构复杂的肽分子。最终，修饰后的肽可以通过反应生成的亲电弹头与其他生物分子共轭。因此，这种策略为肽修饰和肽-药物缀合物设计提供了一个重要的工具箱。我们预计这个工具箱将在肽化学生物学和肽药物发现领域有广泛的应用。MBH碳酸酯可以通过在叔胺催化下通过SN2'-SN2'途径实现色氨酸吲哚N1-烯丙基化，最终在温和条件下无需金属催化即可实现肽的后期功能化和大环化，将亲电性丙烯酸酯“弹头”引入感兴趣的肽中（方案1b）。然而，从精确性角度来看，必须考虑几个挑战：1) 肽中存在各种竞争性亲核性功能团，如-SH（Cys）、NH2（Lys）、-OH（Tyr、Ser、Thr）等，控制化学选择性是一项艰巨的任务；
2) 吲哚环上的多个竞争性活性位点，特别是电子丰富的C2=C3区域，使其区域选择性控制极其具有挑战性；
3) 潜在的立体选择性控制也是一个挑战。
首先，研究了不同的无机碱和叔胺催化剂，发现DABCO表现出最高的催化活性。然后进一步筛选参数以优化反应。溶剂的选择对产率有显著影响，DCM被证明是最佳溶剂。令人高兴的是，当催化剂负载增加到20摩尔%时，反应时间缩短到1小时，产率没有损失。此外，也对色氨酸与其他具有亲核性残基的天然氨基酸的化学选择性进行了研究。这一反应展示了与Trp、Tyr、His的专一性化学选择性，但与Lys、Arg、Ser和Cys的选择性不尽人意。有了最佳条件，接下来探索了所提出方法的底物范围。首先，研究了烯丙基化方案对广泛的含Trp肽的普适性（见图1）。令人高兴的是，所有含Trp残基的肽都与2a反应良好，得到相应的产品，产率高（高达99%）。所有二肽和三肽，包括赖氨酸和酪氨酸等保护残基，都被转化为烯丙基化产品，产率极佳（3b-3i）。这一成功的应用鼓励了对更复杂肽结构的探索。高兴的是，这种方法对四肽、五肽和七肽的转化证明是稳健的（3j-3n）。此外，Trp残基在肽序列中的位置可以被分为N-末端、内部片段和C-末端；然而，结果表明，位置对转化的影响微乎其微（3d、3f和3h）。相反，肽序列中氨基酸的组成对转化有更显著的影响，这可能是因为这些肽在DCM中的溶解度低（3j、3l和3m）。更重要的是，这些发现证明了我们方法的实用性，可以直接修饰生物活性肽（如内啡肽-1、3k和旋肽、3n），而无需依赖于基于预官能化构建块的长期全新合成。![]()
接下来，将注意力转向通过与各种MBH碳酸酯的顺利连接来研究这种烯丙基化策略的适用性（见图2）。所有的MBH碳酸酯衍生物都与Boc-Leu-Trp-Phe-OMe三肽顺利反应，以良好至极佳的产率提供了所需的产品（高达94%）。如图2所示，包括乙基、叔丁基和苄基酯在内的不同丙烯酸酯的反应都有效进行，产生了相应的烯丙基化产品，产率良好（4a-4c）。这一成功表明，烯丙基化为调节肽的物理和生物学性质提供了一个独特的机会，通过引入不同特性的各种取代基团。脂质化和聚乙二醇化（PEGylation）的基团可以与三肽组装，以调节亲水性和疏水性，在良好的产率下（4d、4e）。聚乙二醇化对增强肽的药效学性质，进而在药物传递中应用也是具有吸引力的。同样，双正交炔烃基团与肽的连接为进一步的点击化学反应提供了条件，以极佳的产率（4f、94%）得到了结果。这种烯丙基化策略使肽通过与香豆素荧光染料组装，实现了位点特异性荧光标记（4g、68%）。多样的含Trp肽的N-烯丙基化也证明了与生物活性分子的连接是可行的。糖基化可以调节参与各种生物过程的肽和蛋白质的性质和功能。在我们的实验条件下，掩蔽的半乳糖有效地与Trp残基结合，以良好的产率产生了糖基化肽（4h、83%）。此外，几种天然产物和药物，如香叶醇、(L)-薄荷脑、L(-)-莰醇、表雄酮和胆固醇，在标准条件下也能以中等到良好的产率有效地与三肽的Trp残基结合（4I - 4m）。这些结果展示了这种化学在构建肽缀合物方面的潜力。此外，还进一步探索了空间位阻较大的带有苯环的MBH碳酸酯的范围（见图2）。经过对手性叔胺催化剂的精心筛选，我们发现双功能催化剂beta异莰胺(β-ICD)能有效地催化Boc-Trp-OMe的烯丙基化，并以优异的产率（98%）和7.1:1的d.r.提供了产品，表明在过渡态中适当分布的氢键可能在传递立体化学信息中发挥重要作用。此外，与Boc-Leu-Trp-Phe-OMe三肽的反应也顺利进行，以99%的产率和5.3:1的d.r.提供了烯丙基化产品（4n）。然后考察了一系列带有苯环上卤素取代基的MBH碳酸酯。所有的MBH碳酸酯都以良好的产率和适中的对映体选择性提供了相应的产品（4o - 4q）。当使用含有强电子吸引基团（如NO2）的MBH碳酸酯时，反应顺利进行，并以中等产率（53%）提供了4r。烯丙基化也使用带有脂肪族和苯环上萘基取代基的MBH碳酸酯顺利进行（4s, 4t）。这些结果展示了有机不对称催化在肽晚期修饰中的巨大应用潜力。![]()
由于大环肽可以显著提高细胞摄取、代谢稳定性以及与目标的结合亲和力，因此开发构建大环肽的策略至关重要。接下来研究了通过分子内Trp烯丙基化方法制备大环肽的实用性（见图3A）。通过使用烷基MBH碳酸酯交联剂的分子内方法，以中等到良好的产率获得了烯丙基化修饰的大环肽。为了提高这种分子内大环肽的产率并避免有害的二聚体和低聚物形成，在简单筛选反应浓度后稀释了反应混合物。令人高兴的是，在稀释条件下，一系列线性肽顺利环化，具有极好的化学选择性，并且产率良好，形成了17至35个成员的大环（5a - 5f）。各种氨基酸（如天冬氨酸和丝氨酸）在这些条件下可以被容忍。天然氨基酸（如谷氨酸）的功能性侧链也可以用于连接MBH碳酸酯基团。因此，环肽（5e）在中等产率（49%）下容易被获得。随着线性肽长度的增加，产率并没有降低。当线性肽序列包含β-转角基序时，环化产率略高于不含β-转角基序的序列（5f）。订书肽是合成具有α-螺旋构象的大环肽的重要策略。进一步研究了通过分子间Trp烯丙基化方法构建订书肽的实用性（见图3B）。通过使用不同长度的烷基MBH碳酸酯与四肽进行分子间烯丙基化，获得了含有30 - 34个成员的三种大环肽（5g - 5i）。这种订书方法可以引入与肽中固有氨基酸更多样化的订书连接，避免了非天然氨基酸的合成和结合。最后，还探索了使用固相肽（见图4）的策略。为此，首先在固相肽合成（SPPS）过程中将未保护的Trp残基结合到肽中。然后，探索了烯丙基化以获得期望的修饰生物活性肽和片段，具有良好的化学选择性和产率（6a - 6f）。值得注意的是，尽管存在非均相反应条件的限制，这种强大的有机催化烯丙基化在固相上成功发生。这可能为制备多样化的肽前药类似物提供了一种快速而有效的替代方法。为了进一步扩展这种化学的能力，作者利用肽中结合的Michael受体和肽中半胱氨酸残基的硫醇基团，通过thia-Michael加成反应构建了肽-肽缀合物（见图5）。通过固相烯丙基化准备的修饰肽（6e）与含有1个半胱氨酸的13个氨基酸的寡肽（P-10: AP02702）在37℃和pH 8.35下反应1小时，并通过LC-MS/MS进行了分析。高兴的是，在温和条件下，肽-肽缀合物被高效地构建。
