酰胺键的形成是药物化学中最常用的化学反应；大约50%的药物发现论文包含酰胺键的形成，是30年前数量的两倍。近年来，由于中等大小肽类药物的出现，有效的酰胺键形成变得尤为重要，与小分子药物和抗体相比，这些肽类药物经常表现出独特的特点和优势。传统的肽合成通过使用过量的N-保护的羧酸和缩合试剂从C末端到N末端逐步延伸肽链，以最小化外消旋化（图1a）。 图片来源：Communications Chemistry. 结合固相合成，C-to-N延长方法已经能够方便地构建大约50个氨基酸残基的肽，并且引入了革命性的自动化流动系统。此外，结合固有化学连接方法，合成含有400个甚至更多氨基酸残基的蛋白质也是可能的。通过化学合成能够生产的肽/蛋白质的最大尺寸正在迅速增加。尽管C-to-N肽合成具有高保真度和可靠性，但每次肽键形成都需要多次保护基团操作，而且缩合试剂不可回收会产生废物。例如，一个氨基酸的平均分子量约为110，但常用的保护基团（Cbz: 135, Boc: 101, Fmoc: 223）或缩合试剂（EDC-HCl: 191, HATU: 380, COMU: 428, BOP: 442）的分子量与底物相当或更大。此外，使用简单的C-末端酯保护基团时，二肽以上的C-to-N延长经常遭受二酮哌啶形成的问题。因此，传统的肽合成原子效率低，对环境影响大。在越来越注重环境保护和可持续性的今天，绿色肽合成的需求日益增长。为了追求这一点，非经典的酰胺键形成已被广泛研究，一些已被应用于C-to-N寡肽合成。然而，许多方法仍然需要苛刻的条件（如高温下共沸除水）、超化学计量的试剂有时难以获得，并且需要保护基团。N-to-C肽延长（图1b）由于难以抑制C-末端氨基酸残基的立体中心的消旋化，研究程度不如C-to-N的合成。由于正在延伸的肽链中的氨基和要引入的氨基酸中的氨基已经分别作为酰胺和胺基团区分开来，这种策略在提高原子和步骤效率方面具有潜在优势，可以通过最小化保护基团操作。本期小编就给大家介绍一种迭代的、实用的N-to-C肽合成方法，该方法在液态相中进行，消旋化最小。这种方法允许使用非保护氨基酸，不需要复杂的缩合试剂，从而显著提高了液态相肽合成的原子经济性和步骤效率。此外，这种方法还适用于收敛片段耦合，正如在简短且可扩展的生物活性肽合成中所展示的。（文献：doi.org/10.1038/s42004-023-01030-0）为了实现N-to-C肽合成，作者采用了肽硫羧酸（PTC）平台（图1b）。在各种条件下使用PTC形成酰胺键已有报道，但PTC从未在迭代的N-to-C肽合成中使用。基于之前开发的使用催化二乙酰硫化物（Ac2S）和硫代乙酸钠（AcSK）从肽中一步合成PTC的方法，作者构想了图1b所示的方案。将C末端羧酸转化为PTC，区分了正在延伸的肽链和要引入的氨基酸，而无需保护基团。肽键形成后，新的C末端羧酸可以直接用于PTC形成，开始下一个延伸周期。元素硫和水是肽键形成步骤中产生的唯一废物。图片来源：Communications Chemistry. 条件优化：首先，使用1a合成三肽2aa来优化基于PTC的N-to-C延伸（表1）。尽管PTC本身对酰胺形成不活跃，但氧化二聚的二硫二酰化合物是活性酰化物种。首先寻找将1a原位转化为二硫二酰化合物的空气条件，这将被丙氨酸钙盐（Ca(Ala)2）捕获。使用铁(II)酞菁（FePc）催化剂在开放式空气中的DMF中，三肽2aa以22%的产率获得（条目1）。接下来，筛选了N-羟基胺/酰胺/亚胺添加剂，以提高反应性，同时保持低消旋水平（条目2-6）。在测试的添加剂中，3-羟基-1,2,3-苯三嗪-4(3H)-酮（HOObt）提供了可接受的结果，以33%的产率和<1%的消旋化生成2aa（条目6）。当浓度增加到100 mM时，产率提高到68%，消旋化仍然受到抑制（<1% epi. 水平，条目7）。然后，将相同的条件应用于空间位阻更大的二肽1b。然而，产品三肽2ba的产率仅为35%，消旋化水平增加（6.1% epi. 水平，条目8）。HPLC分析显示FcPc在缩合之前降解了来自1b的二硫二酰中间体。因此，我们去掉了FePc，产率提高（64%，条目9），尽管反应缓慢（22小时）且消旋化水平仍然较高（4.9% epi. 水平）。当使用丙氨酸（H-Ala-OH）代替Ca(Ala)2以减少反应体系的碱性时，消旋化水平降低到1.3%（条目10）。使用DMSO作为溶剂以促进二硫二酰形成，产率提高（70%），但消旋化水平增加（4.5% epi. 水平，条目11）。当反应在较少极性的DMSO/甲苯混合溶剂体系中进行时，消旋化水平降低（1.8% epi. 水平，条目12；表S1）。进一步研究N-羟基酰胺添加剂，我们发现N-羟基-2-吡啶酮甲酯（HOPOMe）提高了产率，并将消旋化水平降低到<1%（条目13）。增加丙氨酸（2.0当量）和HOPOMe（2.0当量）的量，提高了反应性，在6小时内得到了86%产率的2ba（条目14）。然而，从三肽产品中分离出结晶HOPOMe是困难的。进一步的结构调整得到了最佳添加剂HOPOPhy（条目15），它可以通过简单的己烷洗涤轻松回收并重复使用。 底物范围和限制在开发了实用的产品分离方法（再结晶或快速色谱，见实验操作）之后，作者使用优化的条件来调查底物的普遍性（图2）。首先，使用1b作为肽底物，研究了要引入的氨基酸的普遍性（图2a）。反应以高收率（78-99%）和<1-1.8%的消旋化水平进行，适用于带有疏水性（Val：2bb，Phe：2bd，Ile：2be，Met：2bf，Trp：2bg，tLeu：2bp）或受保护（Cys：2bh，Lys：2bn，Arg：2bo）侧链的氨基酸，因为它们在优化溶剂中有可接受的溶解度。特别是，空间位阻较大的氨基酸tLeu被引入到1b中，以产生含有高度拥挤序列（Phe-Val-tLeu）的三肽2bp，产率高（93%），消旋化水平<1%。Ala和Gly在溶剂中的溶解度很低，产生了稍高的消旋化水平（大约2ba为2.1%，2bc为1.0%）。对于相对溶解度较低的带有极性侧链的氨基酸（Thr，Tyr，Asp，Asn），在上述优化条件下的反应产率较低（9-48%），可能是由于氨基酸浓度不足。在这些情况下，PTC水解先于期望的肽偶联发生。进一步修改反应条件，发现使用不加甲苯的DMSO溶剂，比HOPOPhy更活跃的HOPOMe添加剂，干燥剂（MgSO4）和/或微波辐射，能以高收率（67-94%）和<1%的消旋化水平获得了所需的三肽。对于含有中等亲核性的官能团的氨基酸，不必要进行侧链保护（Trp：2bg，Ser：2bi，Thr：2bj，Tyr：2bk，Asn：2bl和Asp：2bm）。图片来源：Communications Chemistry. 关于PTC上的N-末端保护基团，Fmoc和Boc基团也与当前方法兼容（图2b：2cb和2db）。对于正在延伸的肽的C末端氨基酸，反应在Phe（2ab）和Pro（2gb）残基上进行，没有可检测的消旋化（图2c）。此外，这种方法可以扩展到两个肽片段的收敛耦合。在用N,N-二异丙基乙胺（iPr2NEt）从肽的三氟乙酸（TFA）盐中解放出要引入的肽的N-末端胺后，二肽之间的片段耦合进行，得到四肽2br，产率为99%，没有消旋化（图2d）。由于肽片段的溶解度比无保护的单氨基酸要高，因此只需要轻微过量（1.2当量）的C末端片段。图片来源：Communications Chemistry. 可放大的液相生物活性肽合成方法作者将该方法应用于生物活性非肽delta-睡眠诱导肽（DSIP）的合成（图3）。DSIP被逆合成为三个三肽片段，片段1-3。作为每个片段的起始氨基酸，选择了Boc-Trp用于片段1，目的是在最后一步中在酸性条件下进行全局去保护，以及Fmoc-Gly和Fmoc-Ser分别用于片段2和片段3，以便在两次片段耦合之前进行选择性去保护。将C末端羧酸转化为PTC后，在上述条件下进行了无保护氨基酸的耦合（图3a）。图片来源：Communications Chemistry. 提取后的粗产物用乙酸乙酯（AcOEt）和溶剂蒸发后，用己烷洗涤以提取HOPOPhy（回收率为75-95%）。回收并纯化的HOPOPhy可以重复使用而不会损失活性。然后，含有产品肽的残留物溶解在AcOEt或MeOH中，溶液用活性碳处理。这个过程有效地去除了常常对下一次肽耦合和纯化造成问题的残留硫化合物。随后通过硅胶柱色谱纯化，得到了足够纯度的所需二肽和三肽，以供下一次迭代或片段耦合使用。去除Fmoc基团时，使用三乙胺作为碱。蒸发后，粗混合物溶解在由水和醚组成的双相溶剂中，其中包含产品肽和Fmoc衍生的副产品。水相被分离并通过冷冻干燥得到产品。因此，片段1-3以纯形式合成，并且可以大规模制备（每个>300毫克）。然后进行片段耦合（图3b）。将片段1转化为PTC后，与片段2的反应产生了六肽3，产率为66%（2步），无需柱色谱。六肽3进一步转化为PTC并与片段3耦合，产生了保护的DSIP 4，产率为56%（2步），无需柱色谱。最后，全局去保护和通过反相柱色谱纯化得到了130毫克DSIP，产率为62%（图3c，d），展示了当前方法在提供中等大小生物活性肽方面的实用性。图片来源：Communications Chemistry. 机理研究为了深入了解肽耦合的机理，通过HPLC对反应进行了时间监控。当PTC 1b在没有耦合伴侣的情况下在空气中搅拌时，1b在1小时内氧化二聚形成5（图4a）。在HOPOPhy存在的指定条件下，PTC 1b在1小时内被消耗，产生了三肽2ba，产率为81%。在反应过程中通过HPLC确认了元素硫（S8）的形成。在反应的初始阶段（t < 30分钟）观察到二聚体5，但在3小时内被消耗并转化为活性酯6。然后，6逐渐与丙氨酸反应，并在4.5小时后完全转化为三肽（图4b，c）。根据这些反应剖面，限速步骤可能是活性酯6和氨基酸之间的肽键形成步骤。图片来源：Communications Chemistry. 基于上述观察，作者提出了一个可能的反应机理，如下图所示。首先，PTC 1在有氧条件下二聚形成二硫二酰化合物7。DMSO溶剂加速了这个氧化步骤。然后，二硫二酰化合物7与添加剂HOPOR反应生成活性酯8，通过形成草酰胺抑制了不希望的消旋化。释放的酰基二硫化合物9与1反应生成7和H2S，或与HOPOR反应生成活性酯8和H2S2。活性酯8逐渐与非保护氨基酸或肽片段反应，产生延伸的肽2。H2S和H2S2经过氧化释放稳定的S8和水作为唯一的副产品。图片来源：Communications Chemistry. 实验操作Procedure for gram-scale N-to-C peptide coupling (represented by the synthesis of Fragment 1). Toa solutionof Boc-WA (1.18 g, 3.14 mmol) and potassium thioacetate (3.59 g, 31.4 mmol, 10 equiv) in DMF (31.4mL), diacetyl sulfide (65.7 μL, 0.628mmol, 0.2 equiv) was added dropwise at 0°C and the mixture was stirred for 3.5 hours at 0°C under an argon atmosphere. Ethyl acetate, water, and 1M HCl aq. were added to the reaction mixture to stop the reaction. The products were extracted with ethyl acetate. The combined organic layers were washed with water, 1 M HCl aq., and brine, dried over Na2SO4, andfiltered. Volatiles were removed under reduced pressure to afford the crude PTC (Boc-WA-SH). This crude product was used for the peptide coupling reaction without further purification.Boc-WA-SH. (estimated as 3.14mmol) dissolved in DMSO (6.5 mL) was addedto a mixture of glycine (471mg, 6.18mmol, 2.0 equiv), HOPOPhy (2.05g, 4.71mmol, 1.5 equiv), and toluene (6.5 mL) in a test tube for a microwave apparatus. The mixture was stirred under microwave irradiation at 40°C for 3hours. Ethyl acetate, water, and 1 M HCl aq. were added to the reaction mixture. The mixture was extracted with ethyl acetate. The combined organic layers were washed with brine, dried over Na2SO4, filtered, and volatiles were removed under reduced pressure. Hexane (150 mL) was added to the residue and the mixture was sonicated to precipitate out the peptide product. The precipitates were collected by filtration and washed with hexane. Then, the filtrate was evaporated under reduced pressure for recovering HOPOPhy.The resulting residue from hexane was purified by column chromato graphy (neutral silica gel, hexane/ethyl acetate = 80:20 → 50:50) to afford HOPOPhy, which was reusable for another peptide coupling reaction (1.95 g, 95% recovery).
