通过Ynamide的氢硫化实现肽和蛋白质中半胱氨酸的选择性修饰

文摘 2024-10-29 08:30 四川

选择性化学蛋白质功能化是化学生物学的基石，它使得目标生物分子的精准工程化成为可能，进而促进了生物过程的调查和靶向治疗的发展。近年来，各种各样的蛋白质生物偶联化学，包括2022年诺贝尔化学奖认可的生物正交点击化学，已经被开发并在广泛的应用中得到使用，如荧光标记、偶联基础治疗和基于活性的化学蛋白质组策略。随着精确蛋白质功能化先进指数影响的增加，对新的高效生物偶联方法的关注也日益增加。遗传密码扩展是一种独特的技术，通过在重组目标蛋白中引入设计的氨基酸来实现位点选择性蛋白质修饰。或者，直接偶联可以在不预先安装功能基团的情况下，将设计的分子化学连接到天然蛋白质的预定位点。它们的发展挑战是多方面的，这是由于需要高效率、独特的反应性、出色的选择性和温和的水性条件。在开发的化学选择性蛋白质修饰中，以半胱氨酸（Cys）为基础的策略，包括N端或C端特异性方法，特别有吸引力，并已广泛用于多种天然蛋白质的功能化和蛋白质偶联的生成，这得益于其独特的亲核性、溶剂暴露和低自然丰度。这在蛋白质表面还原形式的Cys中尤其如此，它们可以随时进行化学修饰。已经开发了各种Cys特异性修饰，包括Michael加成、高碘酸碘介导的反应、金属介导的反应、亲核取代、硫醇的umpolung、自由基转化、去硫耦合和二硫键重桥接。在这些策略中，与马来酰亚胺的Michael加成是最广泛使用的，用于体内外修饰感兴趣的蛋白质。尽管这些反应的快速动力学吸引了相当大的注意，但两个主要缺点包括在存在外部硫醇（如谷胱甘肽）时结合产物的化学选择性低和稳定性差。此外，基于循环1,3-二羰基骨架的化合物多样性被开发用来探测半胱氨酸磺酸（Cys-SOH），这也可用于Cys标记（但在存在氧化剂的情况下）。同时，Cys特异性蛋白质修饰技术已被适应于化学蛋白质组学半胱氨酸分析，这使得感兴趣的反应热点的特征化，并为新药靶点的发现提供了见解。Cys-烷基化与碘乙酰胺是自上而下蛋白质组分析样品准备的一个关键步骤；然而，在许多情况下检测到在其他残基而非Cys的非特异性烷基化。最近采用创新的Michael受体，如丙烯酰胺、含磷电子缺陷炔烃和基于异吲哚的丙烯烯，提供了有希望的结果。特别是，Loh小组开发的在α,β-不饱和羰基化合物的β位置引入硅取代基显著提高了化学选择性并避免了逆Michael加成。尽管取得了重大进展，复杂的生物系统在实现偶联产物精确异构体的合成中仍然存在挑战，这对于化学蛋白质组分析和药物发现至关重要。此外，确保这些产品的稳定性也是一个持续的挑战。

图片来源：ACS Cent. Sci.

Ynamides以其强极化和直接连接到炔丙烯C−C三键的供电子氮原子为特征，提供了稳定性和反应性之间的最佳平衡。这种平衡通过氮上的吸电子基团（EWG）进一步调节，允许通过两个极化的共振结构选择性地在α-或β位置进行化学转化。最近披露，Ynamides可用作一类新的通用偶联试剂，用于酰胺和酯键的形成，利用羧酸的质子化引发的Ynamides的α加成，这也已应用于活细胞中羧基残基的分析。

本期小编就给大家介绍赵军峰老师发展的一种利用Ynamide实现肽和蛋白质的Cys特异性功能化，该方法具有高效的化学、区域和立体选择性β-氢硫化。优良的化学和区域选择性由基础反应条件和带有强吸电子基团的设计控制，这抑制了质子化引发的α加成。（ACS Cent. Sci. 2024, 10, 9, 1742–1754）

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合理设计的Ynamide的生物相容性β-氢硫化

对Ynamide化学的研究始于这样一个洞见：氮原子上存在一个吸电子基团(EWG)在促进β-加成中起着关键作用，如共振结构I（图1b）所示。这一理解指导了我们合理设计Ynamide，选择性地在基础反应条件下与半胱氨酸进行β-氢硫化，以规避竞争性的质子化引发的α-羧基化，特别是对于含有羧基的肽。

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为此，N-甲基-邻-甲苯磺酰胺(MYTsA, 2a)，作为第一代Ynamide偶联试剂用于肽合成，在模型反应中作为参考进行了测试。如图2a所示，2a的β-氢硫化(2当量)与模型二肽Boc-Ala-Cys-OEt(1a, 1 mM)在乙腈(MeCN)中顺利进行，使用Na2CO3(2当量)作为碱，得到偶联产物(3aa)，收率90%，立体选择性优异(Z:E > 99:1)。进一步的优化是为了在生物相容的条件下实施这一化学，如水性介质、近中性pH(6−8)和生理温度。同时，2a的水溶性差导致了在MeCN/磷酸盐缓冲液混合物(pH 8, 3:7)中反应缓慢，24小时内得到3aa的收率为80%。通过将R2的甲基替换为2-羟乙基(2b)来增强溶解性，导致了更有效的反应，得到3ab的收率为89%。随后评估内部Ynamide(2c)没有在相同条件下反应，这表明R1取代基的关键作用。将2a的对甲苯磺酰基(Ts)替换为三氟甲基磺酰基(triflyl, Tf, 2e)增强了在水中的溶解性和反应效率，由于其更强的吸电子能力和增加的亲水性。这种修饰使得反应在含有最小MeCN(5%)的磷酸盐缓冲液中在20分钟内完成，以95%的收率得到产物(3ae)作为单一Z-异构体，通过NMR确认(Z:E > 99:1)。进一步探索具有不同功能基团的Ynamides(2f)和(2g)，显示出相当的效率。这强调了通过R2基团修饰实现Ynamide功能化的通用性，有望在合成多样的偶联物中广泛应用。Z异构体的专一形成可能归因于反式加成的低能量过渡态，而E异构体的形成由于不利的电荷排斥而不被支持(图1b)，这一结论得到了Hentz等人的DFT研究的支持。

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最佳Ynamide(2e)与肽(1a)的偶联对pH敏感，在中性条件下(6−7.5 pH)反应缓慢。此外，使用5当量的2e显著改善了反应，5分钟内实现定量转化。使用谷胱甘肽(GSH)对Ynamide(2e)进行硫醇偶联的表观二阶速率常数为0.2399 ± 0.002 M−1 s−1。为了进一步剖析反应机制，在不同类型自由基清除剂存在下进行了反应；对反应效率没有负面影响。此外，在水介质中检测了Ynamide的硫基自由基化学，但没有检测到反应。这些结果排除了这种转化的自由基机制。

化学选择性研究（未保护的氨基酸侧链对该方法没有影响）

接下来，研究了在其他未保护的氨基酸侧链存在下这种策略的化学选择性情况(方案1a)。当含有Asp和Glu的三肽(1b和1c)在标准反应条件下与2e处理时，即使在延长的反应时间(5小时)后，也检测不到反应，表明羧酸对Ynamide的正常α-加成完全被抑制。这归因于在基础反应条件下羧基被去质子化，从而禁止了质子化引发的α-加成。此外，考虑到在强碱存在下Ynamide可能与吲哚和酰胺的β-氢酰胺化，含有组氨酸(His, 1d)、赖氨酸(Lys, 1e)、精氨酸(Arg, 1f)和色氨酸(Trp, 1g)的三肽被研究。有趣的是，所有这些侧链在优化的反应条件下都保持完整。在优化的反应条件下，未保护的亲核羟基丝氨酸(Ser, 1h)和酪氨酸(Tyr, 1i)也兼容。接下来，在所有可能的反应侧链存在下进行了Cys的化学选择性修饰(1j和1l)。值得注意的是，1j和1l的反应分别在20分钟和2小时内完成，以优异的收率得到了单一的偶联产物，并通过胰蛋白酶消化3le确认了修饰位点在Cys残基上。正如预期的那样，当Cys被Met(1k)替换时，没有检测到修饰。所有针对肽侧链功能基团的化学选择性研究表明，碱促进的Ynamide的β-加成与Cys的硫醇基团是正交的。该方法的稳健性进一步通过复杂的肽底物(1m−1q, 方案1b和1c)进行评估。在标准反应条件下，还原型谷胱甘肽(GSH, 1m)可以被Ynamide 2e修饰，得到优异的收率。含有一个末端和一个内部Cys残基的还原型催产素(1n)可以在20分钟内以优异的收率进行双功能化，而氧化型催产素则不活跃，表明Cys在序列中的位置不影响修饰的效率。此外，一个有效的αVβ3整合素结合环肽18g(1o)被用于这种转化，以76%的收率提供了所需的Cys特异性修饰产物。最后，两个带有高度正电荷和负电荷序列的肽，1p和1q，被选为关键例子，以评估这种转化的静电效应。1p和1q的Cys特异性修饰在标准条件下顺利进行，表明高度带电的肽对反应没有负面影响。

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Ynamide作为生物学相关分子用于肽修饰

为了证明这种策略在肽和蛋白质化学生物学中的应用，不同的生物学相关功能基团，包括荧光标记(香豆素，2h)、复杂药物分子(吲哚美辛，2i)、亲和标记(生物素，2j)和用于生物偶联的炔烃柄(2k)，被引入到Ynamides中，并通过使用含Cys的肽进行评估(方案2)。受保护的肽(1a)、环肽(1o)和未受保护的肽(1r)与各种重要的基于Ynamide的功能分子(2h−2k)的选择性修饰在含有MeCN作为共溶剂的缓冲液中顺利进行，以优异的收率得到所需的产品(方案2)。

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Cys的一锅法双功能化与点击化学（该方法与点击反应完美兼容）

考虑到点击反应的重要性，接下来研究了该方法与点击反应的兼容性。如图3所示，肽1l的Cys首先被Ynamide 2k有效修饰，得到含有额外C−C三键的Z-偶联产物5lk，该产物在随后的点击反应中与生物素-PEG3-叠氮化物(2m)反应，以一锅法方式将生物素标签锚定到肽上，得到目标双重功能化产品(5lm)，收率为90%(方案3)。这样一锅法、两步双重功能化的优秀效率无疑说明了该策略在锚定生物素标签或其他有用功能基团到感兴趣肽的潜力和灵活性。

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肽偶联物的稳定性研究（相当稳定）

偶联产物的稳定性对于开发强大的肽和蛋白质修饰策略至关重要。没有观察到偶联产物3ae (1 mM)在pH 2、8、10和13的缓冲溶液中分别孵育10小时的恶化。此外，Ynamide修饰的肽，3ae (10 μM)，在用大量H2O2处理时，即使在延长时间(24小时)后，也没有经历β-消去，这在某些方法中是常见的，即使在pH 4、8和10的条件下在37°C下处理。进一步，3ae在牛血清中孵育10小时后仍然保持完整。此外，没有检测到在其他方法中发生的3ae在外部硫醇存在下再生未修饰的1a的裂解(使用2-巯基乙醇)。相反，碘乙酰胺(IAM)肽偶联物在上述条件下分解。修饰产物的卓越稳定性进一步提高了其在构建肽和蛋白质偶联物中的应用潜力。

Cys含蛋白质和抗体的修饰（在蛋白质Cys修饰中的应用）

接下来，研究了Ynamide β-氢硫化在蛋白质Cys修饰中的应用。生物素化Ynamide (2j)被轻易地制备并用作蛋白质Cys修饰的模型底物。用化学蛋白质合成方法制备的泛素(G47C)变体(6, 250 μM)与5当量的2j在pH 8和37°C下处理12小时，得到生物素标记的泛素(G47C*) (7)，收率为43%(HPLC纯化)(参见图3a)。相比之下，在相同的反应条件下，即使在18小时后，也没有观察到泛素(G47A)变体的修饰，证实了Cys的选择性。有效的化学、区域和立体选择性生物素化泛素(G47C)变体(6)无疑说明了这种策略在构建蛋白质偶联物中的潜在应用。

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此外，还考察了牛胰蛋白酶抑制剂(BPTI)的修饰，它是一个含有58个残基的Cys富集蛋白，具有三个二硫键。首先，BPTI (8, 250 μM)用1.5当量的三(2-羧乙基)膦(TCEP)处理，该膦选择性地还原部分溶剂暴露的Cys14−Cys38二硫键，而其他两个埋藏的二硫键保持不变，然后加入10当量的2e/2j。12小时后，相应的双修饰蛋白(9a和9b)分别以21%和29%的收率(HPLC纯化)被分离出来(参见图3b)。尽管在两种情况下都检测到还原的Cys残基氧化形成天然8的二硫键的8%，但没有观察到对BPTI的其他二硫键的干扰。

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BSA (10)是另一个含有17个二硫键和一个自由Cys残基(Cys34)的二硫键富集蛋白。当BSA用Ynamide 2j处理时，只观察到单加成物，通过MALDI-TOF确认(参见图3c)。这种转化与二硫键的兼容性意味着该协议在复杂生物系统中的应用潜力。例如，选择Her2靶向治疗性抗体曲妥珠单抗(12)作为模型，探索使用Ynamide进行抗体-药物偶联物(ADC)研究的可行性。采用典型的还原-加成程序进行偶联。用10当量的TCEP在37°C下还原40分钟，以解开溶剂暴露的链间二硫键。然后将还原的抗体在37°C下与原型Ynamide 2e孵育20小时，同时去除异质的N-糖苷以简化分析。根据LC-MS分析确认了标记(参见图3d)。观察到每个抗体的标记度为3.7，包括部分在轻链中的一个Ynamide (2e, +217.5 Da, LC1)标记，以及部分在重链中的一个Ynamide (+215.2 Da, HC1)、两个Ynamides (+433.5 Da, HC2)和三个Ynamides (+651.5 Da, HC3)标记(参见图3d)。在没有TCEP还原的对照反应中，没有观察到标记，显示了Ynamides对还原Cys残基的高化学选择性。考虑到I.反应的高化学、区域和立体选择性，以及II.形成的C−S键的稳定性，Ynamides在ADC基础治疗中具有很大的潜力。

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通过Ynamide基础生物偶联与荧光素或PEG聚合物生成三功能蛋白

为了进一步测试Ynamide基础生物偶联是否损害蛋白质的活性或功能，准备了一个具有肿瘤靶向和荧光发射能力的双功能蛋白作为演示。在这个杂交蛋白中，mCherry作为易于检测的追踪基团，而抗EGFR affibody作为靶向成分，用于特定检测在各种肿瘤中经常过表达的EGFR抗原。在这个蛋白中引入了一个Cys残基，与Ynamide (Affibody-mCherry-Cys, 30, 图4和图S79)进行共轭。为了赋予这个双功能蛋白额外的性质，使用了水溶性Ynamide荧光标记试剂(FAM-ynamide, 31)，其中含有亲水的短链聚(乙二醇)(PEG)。用TCEP预还原的affibody-mCherry-Cys (30, 100 μM)暴露于Ynamide-FAM (31, 1 mM)在PB (pH 8.0)中12小时，37°C下，成功地产生了一个带有EGFR靶向基团和双色荧光元件的三功能蛋白affibody-mCherry-Cys-FAM (32)。这通过凝胶中观察到的由于FAM和mCherry信号合并而产生的黄荧光以及轻微的凝胶迁移向上移动来证明。相反，缺乏Cys残基的阴性对照mCherry-SpyCatcher003 (33)没有显示出这种效果，突出了偶联的硫醇特异性(图4a和图S80)。为了测试这个三功能蛋白是否保留了对EGFR的靶向能力，它被应用于两种癌细胞系(A549和SW620)。在用500 nM和1 μM的32处理40分钟后，只有EGFR阳性的A549细胞显示出共定位的绿色和红色荧光，而在EGFR阴性的SW620细胞中没有检测到显著的荧光(图4b和图S81)，证明了标记后靶向能力仍然存在(图4b)。这些数据坚定地表明Ynamide生物偶联方法可以是一个完全生物相容的工具，用于装饰蛋白质，而不会损害它们的完整性和正常功能，从而为诊断和治疗提供了重要的潜力。随后，鉴于PEG聚合物在增强各种蛋白质治疗剂的稳定性方面的效力，我们想知道我们的偶联方法是否也可以促进PEG化蛋白质的制备。为此，准备了不同分子量的Ynamide功能化PEG聚合物(34: 2 kDa, 35: 5 kDa, 36: 10 kDa, 和 37: 20 kDa)，并用它们与30进行偶联，采用类似于上述描述的程序(图4a)。然后将反应混合物直接用于SDS-PAGE分析，而无需纯化。结果表明，所有PEG尺寸的蛋白质都成功地附加了，这通过Coomassie蓝染色和红色荧光观察到的对应于PEG化产物更高分子量的条带来证明(38−41)。这些结果再次强调了Ynamide基础偶联即使在大分子量PEG的情况下也保持了高效率，强调了其在广泛分子量范围内蛋白质功能化的通用性。这种方法特别有希望用于开发增强的蛋白质治疗剂。

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Ynamide作为蛋白质烷基化试剂在大肠杆菌裂解物样本的蛋白质组学分析中的实施和分析

烷基化或烯基化蛋白质半胱氨酸是当今生物学中使用的几乎所有蛋白质组学工作流程的重要组成部分。为了检验Ynamide探针在生物系统中的特异性和适用性，使用碘乙酰胺(IAM)或Ynamide (2e)对完全还原的半胱氨酸进行烷基化，对大肠杆菌裂解物样本进行了广泛的蛋白质组学分析。大肠杆菌蛋白质被提取，并用过量的DTT还原，然后用IAM或Ynamide 2e处理。在胰蛋白酶消化后，肽段被脱盐并通过LC-MS/MS分析，遵循标准蛋白质组学工作流程，如方法部分所述(见图5a和SI中的更多详细信息)。每种标记方法使用了三个生物学重复样本，每个样本分析了0.3 μg的大肠杆菌肽段。分析揭示了在IAM和Ynamide标记样本中都鉴定出的1178个重叠蛋白质；然而，还有541个蛋白质仅在Ynamide标记样本中被鉴定，而43个蛋白质在IAM标记样本中被鉴定(图5b, c)。重要的是，与IAM 10小时孵育相比，用Ynamide孵育2小时就足以获得类似的完全半胱氨酸标记效率(图5d)。此外，用Ynamide进行10小时的烷基化没有降低标记效率，也没有导致半胱氨酸或其他氨基酸的额外非特异性修饰。相比之下，IAM烷基化导致了大量非特异性修饰非半胱氨酸残基，这也被其他小组观察到。虽然Ynamide可能与IAM一样与相同类型的非半胱氨酸氨基酸发生相互作用，但这种非特异性修饰的程度明显低于IAM标记样本(图5e, f；另见SI中的详细信息，包括图S119，在大肠杆菌和酿酒酵母蛋白质组的两个蛋白质组学实验中，用碘乙酰胺处理后的非半胱氨酸羧甲基化)。此外，有几项研究强调了卤代乙酰胺对含有蛋氨酸和/或色氨酸的肽段的有害影响，特别是在蛋白质组学分析中；例如，参见参考文献51。这使得Ynamide成为一个更优的硫醇陷阱试剂，可以潜在地用于依赖于差异烷基化试剂高特异性的氧化还原蛋白质组学和结合多种PTMs定量的复杂蛋白质组平台。

图片来源：ACS Cent. Sci.

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