肽类的位点选择性和化学选择性修饰受到了极大的关注，因为修饰后的序列可以用作探索重要生物学途径的宝贵工具，并显示出改善的治疗应用性能。在这方面，肽大环化尤其成功地实现了增加稳定性和目标亲和力，为功能微调提供了独特的机会。然而，在存在多个相同残基的情况下，实现非保护肽的期望位点的选择性环化是具有挑战性的。为了规避化学选择性问题，引入了带有生物正交反应位点的非天然氨基酸（NPAAs）（方案1A）。已建立的反应单元包括炔丙基-叠氮用于[3+2]环加成和烯烃用于金属催化的烯烃复分解反应。这些反应在温和的反应条件下显示出卓越的官能团兼容性和快速的动力学。然而，这些方法需要安装两个NPAAs，并且导致结构多样性和残基组合有限。
此外，还开发了通过在不同反应条件下与各种天然残基进行选择性环化的单一反应手柄的引入。例如，可以通过固相肽合成（SPPS）将丙烯酸酯和芳基卤化物引入肽中进行亲核加成、交叉偶联和C-H官能化。然而，大多数报道的方法需要严苛的条件（碱、加热等）和保护的肽序列。仍然迫切需要提供具有独特反应性和更好的用户友好条件下肽大环化生物正交性的新NPAAs。高碘酸碘试剂（HIRs）最近作为将官能团转移至肽类的新工具而出现，因为它们具有低毒性、高反应性和选择性。在它们中，乙炔基苯并噁嗪（EBXs）试剂已被用于通过炔烃转移或简单的加成反应来功能化肽类。引入的炔烃可以作为刚性连接体和进一步修饰的反应手柄。基于使用带有源自简单商业氨基酸构建块的EBx核心的非天然氨基酸（NPAA）。理想情况下，这些新的NPAA既可以应用于固相肽合成（SPPS），也可以应用于液相肽合成（SPS），提供完全位点特异性的EBx引入到肽上。然而，成功实施这种方法需要克服几个挑战。
在固相上的Fmoc保护基团脱除和小分子肽合成中的甲酯脱除需要强碱性条件，这可能导致高度亲电的EBx核心降解。
SPPS后全局脱保护和树脂裂解所需的强酸性条件可能导致敏感的EBx试剂降解。实际上，已有报道EBX核心可以被三氟乙酸（TFA）激活用于亲核加成。最后，EBx核心与迭代酰胺偶联和脱保护条件的兼容性尚不清楚。
本期小编就给大家介绍洛桑联邦理工学院Prof. Dr. Jerome Wase对EBx功能化的氨基酸构建块（方案1B）的最新研究。展示了含有EBx的氨基酸可以在SPPS和SPS中使用。有了多样化的肽-EBx试剂，进一步通过选择性引入EBx试剂开发了几种高效的环肽和双环肽合成方法。
首先合成了在游离胺上含有EBx的非天然氨基酸（方案2A）。作者专注于使用更稳定的EBx衍生物，因为怀疑亲EBX化合物中的羰基在SPPS所需的反应条件下不会稳定。利用选择性酰胺化胺与双官能团EBx试剂2a的方法，很高兴地看到酰胺化与Fmoc-Lys、-Orn和-Dap-OH氨基酸同样有效，通过简单的提取和冻干，以>77%的纯度（通过HPLC-UV校准确定）在克级规模上得到Fmoc-Lys、Orn、-Dap(EBX)-OH（3a-c）。
利用含有EBx的氨基酸构建块，接下来检验了它们与SPPS和SPS的兼容性，以合成肽-EBx（方案2B）。粗制的Fmoc-Lys(EBx)氨基酸3a可以直接用于SPPS，结合2-Cl三苯甲基树脂（C-末端自由酸，负载量1.38 g/mmol）或Rink酰胺树脂（C-末端酰胺，负载量0.62 g/mmol），得到肽-EBXs 4a-h。不同的侧链官能团得到了很好的耐受，包括自由酸（4a）、胺（4d）、酰胺（4f）和不同的杂环（组氨酸His（4b）、色氨酸Trp（4a-h）、酪氨酸Tyr（4h））。特别是，化合物4d形式上是选择性功能化两个赖氨酸残基中的一个。到目前为止，在SPPS中仅在最后一个氨基酸上引入了NPAA。令人高兴的是，即使在C末端的六肽上，NPAA的存在也是可能的，尽管产率略有下降（肽4i的产率为19%），这表明试剂足够稳定，至少可以经历5个偶联周期。在4i中，完全选择性功能化一个赖氨酸仅被观察到，通过MS/MS质谱法得到确认。在N-末端（N-Ter）引入EBx可以通过直接与双官能团EBx试剂2a反应得到4j和4k。在4j的情况下，酰胺化选择性地发生在N-末端，因为在此阶段赖氨酸仍然受到保护。在证明了该方法在六肽上的潜力之后，转向了可能具有生物学意义的更复杂肽。物质P，一个11肽，作为神经递质和神经调节器。EBx手柄可以在自由N-末端存在的情况下选择性地引入赖氨酸（4l）。为了进一步挑战EBx核心在迭代Fmoc脱保护和酰胺偶联过程中的稳定性，选择了一个11肽（TSFKEYWALLK-NH2），它包含多个赖氨酸，并且显示出对MDM2的良好结合亲和力，有潜力抑制它与其他蛋白质的相互作用。作者合成了三个在不同赖氨酸位点含有EBxs的类似序列，以及一个未引入EBx的序列，用于比较EBx在迭代SPPS周期中的稳定性。对于所有三个测试的序列（4m-o），与未功能化的肽25%的产率相比，主要产物的产率分别为13%、10%和5%。尽管观察到了一些降解，但很高兴地看到，赖氨酸EBx构建块仍然可以在肽4o的C末端结合，经过10个完整的脱保护和偶联反应周期，总共23个化学步骤。然后，研究了其他含有EBx的氨基酸的使用。成功地在未保护的赖氨酸和N-末端存在的情况下，将含胺的非天然氨基酸Orn（3b）和Dap（3c）EBxs引入，分别在Orn（4p, 4q）和Dap（4r, 4s）上得到EBxs。为了系统地证明EBx在迭代SPPS周期中的兼容性和降解性，进一步选择了几个肽序列（4d, 4j, 4k, 4l, 4n, 4r），并合成了不含EBx核心的线性肽。这些未修饰肽的产率在括号中给出（方案2）。当EBx作为最后一个氨基酸引入时（4d, 4j, 4k），产率只有轻微的下降。对于在SPPS中间发生EBx引入的肽，观察到可接受的分离产率，尽管与未修饰序列相比产率较低（4l, 4n, 4r）。
接下来，检验了EBx氨基酸是否可以应用于SPS（方案3），因为它允许在更大的合成规模上使用较少的试剂。通过与双官能团EBx试剂2a相同的酰胺化反应合成了Boc-Lys(EBx)-OMe（5），并评估了EBx核心与经典脱保护条件的兼容性。使用Boc-Lys(EBx)OMe（5）的SPS可以以N-末端至C-末端和C-末端至N-末端的方式实现。从C-末端至N-末端，可以使用TFA选择性地去除Boc保护基团，以释放胺进行酰胺偶联。二肽序列（Cbz-Pro-Phe-OH（6a）和Boc-Pro-Gly-OH（6b））可以分别在两步骤中以60%和45%的产率偶联到EBx-Lys。对于N-末端至C-末端的合成，EBx氨基酸5首先经过LiOH水解。令人高兴的是，即使在这些严苛的碱性条件下，高度亲电的EBx仍然稳定。随后，所得的自由羧酸可以分别与不同的商业氨基酸或肽偶联，形成肽7a和7b。与在50微摩尔规模上进行的SPPS方法不同，该方法使用了每个偶联步骤中每个周期的3个当量的EBx氨基酸，SPS方法以1.05个当量的EBx氨基酸产率得到了几百毫克的肽-EBxs（高达440微摩尔规模）。
通过SPPS和SPS将EBx选择性地引入肽上，可以产生具有游离胺手柄的肽-EBxs。这种类型的肽-EBxs无法使用以前的方法获得，从而为进一步的肽修饰和环化创造了机会（方案4）。具有游离N-末端和C-末端的线性肽-EBx K(EBx)FGPLAFP)（4t）可以通过SPPS以29%的产率获得。内酰胺化4t得到环肽8a，EBx手柄在侧链上（方案4A）。它的结构接近天然产物pseudostellarin G，已显示抗菌和药理活性。
然后，检验了Cys-Lys Stapling（方案4B）。在作者之前的工作中，通过S-炔基化，然后在最近的赖氨酸残基上进行近距离驱动的酰胺化，在未保护的天然肽上实现了双官能团EBX试剂的Cys-Lys Stapling。现在，固相EBx引入使我们能够在任何赖氨酸上安装反应手柄，从而覆盖这种固有的选择性。首先通过检查带有Cys和Lys(EBx)的六肽4u，建立了这种“反向方向”大环化的效率。尽管在酸性树脂裂解期间只观察到部分Cys-Lys Stapling，也导致了Cys脱保护，但通过将冻干的粗反应混合物置于温和的碱性条件下，可以完成大环化，得到8b，包括SPPS合成在内，总产率为11%。受到这个结果的鼓舞，随后选择了一个18肽α-螺旋肽，其中包括两个在Cys残基的i+4和i+5位置的赖氨酸残基。在我们之前的工作中，在天然肽上观察到Cys-Lys选择性i/i+4 stapling。通过使用SPPS方法在另一个赖氨酸上使用EBx，得到了唯一的i/i+5 stapling产品8c。
接下来，利用SPPS引入EBx来实现选择性的形式赖氨酸-赖氨酸Stapling（方案4C）。利用最近报道的Au催化的Trp C-H炔基化，通过两步一锅法合成了环肽8d：首先是EBx位点上吲哚9的金催化C2 C-H炔基化，然后在碱性条件下进行分子内酰胺化。
选择性SPPS引入EBx还使合成双环肽8e成为可能（方案4D）。肽EBx 4w首先通过分子内Trp C2-炔基化形成第一个环。然后通过分子内N-末端至C-末端内酰胺化闭合第二个环，两步产率为38%，得到8e。
最后，通过结合不同的EBxs氨基酸和金催化大环化，获得了结构多样的环肽（方案4E）。从具有EBxs核心的类似11肽螺旋肽开始，该肽在不同残基上都有EBxs核心，并且既有游离的N-末端也有游离的赖氨酸侧链，高效地实现了Trp到Lys（8f）、Lys到Trp（8g）、Orn到Trp（8h）、Dap到Trp（8l）的肽连接。因此，这种方法为选择性构建结构和拓扑多样性的连接肽提供了重大机会。
总之，作者成功开发了含EBx的氨基酸构建块的合成。证明了高度亲电的EBx核心在SPPS和SPS所需的条件下是可容忍的。这种构建块的用途进一步通过合成结构多样的环肽和双环肽得到了突出。我们相信这种新的非天然氨基酸构建块可以大大扩展肽化学修饰工具箱。
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