无保护肽的位点选择性非对称多氟芳基订书肽策略，外加一个装订手柄！

文摘 2024-07-17 09:30 四川

肽是高效的且具有目标选择性的活性药物成分（APIs），与传统的小分子药物相比，它们具有更好的安全性，这导致它们在多个医学领域的临床批准率不断上升。截至2020年，已有100多种肽被批准用于治疗或诊断应用。然而，酶促降解和膜渗透性是肽类药物开发中的主要挑战。在最近的研究中，如用非蛋白质氨基酸替换天然α-氨基酸残基或将线性肽环化为大环化合物等主链修饰，可以显著改善肽的性质（细胞穿透性、蛋白酶稳定性、目标选择性等），并增强肽作为治疗剂和生物探针的潜力。为此，过去几十年来，人们广泛探索了各种肽大环化和修饰方法。肽大环化可以通过多种方法实现，包括头对尾、头对侧链、侧链对尾或侧链对侧链环化。在这些方法中，侧链对侧链环化通常被称为“装订”。这种技术可以使肽被限制在特定的二级结构中，如α-螺旋、β-折叠和无规卷曲，这不仅可以增强肽的蛋白酶稳定性和细胞穿透性，还可以提高其与目标蛋白的亲和力。近年来，开发了一种特殊的“双组分”装订方法，其中装订基团被设计为带有额外的反应性手柄，适用于调节生物活性、标记或偶联（图1A）。利用这一策略，装订不仅可以锁定肽的构象，还可以通过引入有用的治疗功能（例如，细胞穿透基序、生物素或荧光标签）对装订肽进行多样化的外环修饰。自这种新颖的连接模型以来，它可以方便地获得各种装订肽（订书肽），它在科学界引起了越来越多的兴趣。

图片来源：J. Am. Chem. Soc.

多氟芳烃化合物（ArF）由于其与各种亲核试剂的高SNAr反应活性和本身特殊的化学性质，已经成为肽修饰和生物偶联中越来越受欢迎的工具。Pentelute及其同事通过将ArF（六氟苯或十氟联苯）与未保护的肽结合，开发了一种优雅的肽装订技术（图1B）。所得到的装订肽表现出增加的抗蛋白酶降解能力。值得注意的是，perfluoroaryl装订在运输蛋白和Pt(IV)前药肽用于胶质母细胞瘤治疗的应用中被发现可以增加血脑屏障的穿透性。作为一种强大的SNAr反应的补充方法，也已经开发了基于自由基的脱氟多氟芳烃化（RDP）用于合成取代ArF。与涉及碳亲核试剂和ArF的SNAr反应相比，自由基脱氟在更温和的条件下发生。

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在开发的“双组分”肽装订方法中，经常使用强亲核性基团（-OH、-SH、-NH2（或-NH）、-CO2H）与标准氨基酸（AAs）侧链与装订连接体反应，而含羟基氨基酸（Ser和Thr）β位的相对惰性的C(sp3)−H很少参与反应。作者假设当Ser的β位与ArF反应时，未反应的-OH将作为反应性手柄，用于随后对装订基团进行发散性修饰。除了选择性C(sp3)−H RDP的Ser β位，该假设还涉及β-五氟苯基(β-PhF5)-Ser中间体与Cys残基上的硫醇基团的C-4区域选择性SNAr反应。这一设想的反应序列将导致Ser和Cys残基之间的位点选择性非对称多氟芳烃装订，为进一步的修饰提供了可控的手柄（图1C）。值得注意的是，这种修饰将允许独立变化装订和肽，特别是在肽侧链直接参与配体结合或参与装订过程的情况下。

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在设计这种肽非对称多氟芳烃装订方法时，会遇到了几个挑战；如图1D所示，在Ser残基中比更活泼的-OH基团更难实现β C(sp3)−H键的化学选择性反应性是一个挑战。由于肽侧链中存在的多个官能团的交叉反应，这尤其变得复杂。已知醇-OH基团的去质子化会降低α-C−H的强度并加速烷氧基的氢原子转移（HAT）。最近，MacMillan小组披露了一种通过HAT过程的光诱导和路易斯酸介导的-OH的α-C(sp3)−H活化，这可以抑制氧原子的反应并化学选择性地形成乙醇基α-碳中心自由基。作者假设Ser β位的C(sp3)−H键也可以使用路易斯酸促进的光氧化还原方法激活，从而在Ser β位生成所需的碳自由基。随后的RDP过程将产生βPhF5−Ser。然而，在复杂的肽底物中实现Ser残基的位点选择性RDP需要反应能够区分Ser残基与其他氨基酸残基中的活性基团，如-NH2/−NH（Lys、Arg和Pro）、-CO2H/−CO2NH2（Asp、Asn、Glu和Gln）、杂芳基（Try和His）、-SCH3（Met）和酚类（Tyr），特别是Thr中的竞手β-C−OH。众所周知，由于基于烷基的取代基的电子吸引性较差，室温下p-脂肪族取代基阻碍了五氟苯对亲核攻击的SNAr反应性。报道的五氟苯丙氨酸（PhF5）与烷基硫醇（p-OCH3−PhCH2SH）之间的SNAr协议需要在70°C下加热24小时，并使用强碱（NaOH），这与肽后期修饰不兼容。

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本期小编就给大家分享一种新颖且广泛适用的未保护肽的位点选择性非对称多氟芳基装订策略。这种方法利用Ser β位的C(sp3)−H和Cys硫醇，在非常温和的条件下进行，展示了广泛的肽底物范围和均匀的高产率。重要的是，该装订方法在装订基团中结合了一个额外的手柄，通过引入各种有用的治疗功能，如叠氮基团、极性基团、脂质标签和荧光染料，实现了装订肽的外环修饰。

Ser残基β位C(sp3)−H的自由基脱氟多氟芳烃化：

首先，研究了N-Ac-Ser甲酯（1a）和PhF6（2a）之间的偶联（表1）。令人高兴的是，该反应在DMSO/PhCl中，在室温下进行18小时，使用0.5摩尔%的4-CzIPN、50摩尔%的奎宁环、1.5当量的Zn(OTf)2和3.0当量的NaOAc，得到了所需的产品3aa，分离产率为71%（内标1H NMR产率为80%）。对照实验表明，使用其他可行的光敏剂（包括Ir复合物）时，产率显著较低（条目2和3）。使用其他路易斯酸和溶剂也导致产率下降（条目4和5）。重要的是，在没有光敏剂、路易斯酸、奎宁环或光照射的情况下，基本上没有观察到RDP产物（条目6−9）。在没有NaOAc的情况下，3aa的分离产率急剧下降至14%（条目10）。

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反应的底物范围：

带有不同N-保护基团的Ser衍生物被很好地容忍，并以良好的产率提供了相应的产品（3aa-ca，52−71%产率）。然而，由于Fmoc对所采用的碱性条件敏感，Fmoc保护的Ser与六氟苯的偶联失败了。在反应中使用了具有不同位置上的F原子和各种电子吸引基团的一系列ArF。观察结果表明，芳香环上F原子取代数量的增加会导致产率的提高（3aa、3ab和3ag）。值得注意的是，进行了半克规模（3 mmol）的反应，以60%的满意分离产率和出色的化学选择性得到了产品3aa。对于3,4,5-三氟硝基苯（2c）、3,4,5-三氟苯三氟化物（2d）和1,3-二氯-2-氟-5-（三氟甲基）苯（2e），产率从60%下降到30%，可能由于F原子去除能力的变化。非对称ArF（2f−2k）表现出极好的区域选择性，得到的β-多氟芳基Ser衍生物可以通过色谱法轻松纯化。值得注意的是，在研究的案例中，反应显示出良好到高的d.r.选择性（4:1−19:1）。有趣的是，一些ArF在RDP和SNAr反应之间的反应性表现出显著差异。例如，像五氟吡啶（2l）、2,4,6-三氟硝基苯（2m）和2,4,6-三氟苯甲腈（2n）这样的ArF在与Cys的硫醇基团的SNAr中表现出高反应性，在RDP反应中却完全无活性。正如预期的那样，Ser中的1°醇和Thr中的2°醇的反应性表现出显著差异，后者（4a）在我们的标准条件下完全无反应。还观察到Trp（4b）对该反应条件也保持无活性。这种区别为选择性修饰含有Ser、Thr和Trp残基的肽提供了一个潜在的方法。

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将多氟芳基团引入肽中可以通过极性-π相互作用增强结合亲和力，促进二元系统的共组装以制备超分子结构，并在蛋白质-蛋白质相互作用中实现分子识别。接下来，进一步将RDP反应扩展到肽中的Ser残基。如图2所示，通过修改反应条件（增加光催化剂、Zn(OTf)2和NaOAc的负载量），研究了一系列不同长度和组成的肽底物。无论Ser在肽中的位置如何，保护的二肽和三肽的多氟芳基化都被证明是有效的（图2A，7aa-ca，57−65%）。为了展示这种策略在未保护肽中Ser残基的位点选择性多氟芳基化中的普遍性，使用固相肽合成（SPPS）技术合成了具有暴露的N末端、C末端和侧链的四肽和六肽（6d−6k）。令人高兴的是，RDP反应在C(sp3)−H的Ser β位表现出精确的修饰，即使在其他高反应性氨基酸残基如Lys、Asp、Gln、Arg和Glu存在的情况下，也表现出令人印象深刻的HPLC产率（7da-ka，图2B）。当反应与含有两个Ser残基的肽（6k）进行时，多氟芳基化没有表现出位点选择性，单多氟芳烃混合产物（7ka-I + 7ka-II）与二多氟芳烃产物的比例接近1:1。值得注意的是，这种方法与一系列含有Ser的生物活性肽如Kallikrein抑制剂、Kemptide、Bradykinin和RFRP-123（人类）很好地反应，以中等产率得到了相应的产品，尽管立体选择性较低。这些产品的非对映异构体可以通过半制备HPLC轻松分离（图2C，7la-oa）。尝试使用更大的肽，即胸腺素α-1（一种28氨基酸肽）和胰高血糖素样肽-1（一种31氨基酸肽）作为底物进行反应，在各种条件下均未成功，导致大部分肽底物的回收。这一结果可能归因于较大肽在反应体系中的溶解度差。

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Ser和Cys之间的非对称的多氟芳基装订

为了实现设计的非对称“双组分”装订，基本上需要在β-PhF5−Ser和Cys硫醇之间进行快速且温和的“点击”反应。然而，报道的PhF5 Ala和p-OCH3−PhCH2SH（PMBSH，70°C下24小时，NaOH在H2O/i-PrOH中）之间的SNAr方法与肽装订和修饰不兼容。因此，非常需要一个温和且高效的合成平台，用于Cys和p-脂肪族取代PhF5之间的SNAr，该平台可以应用于肽和小蛋白的修饰，但尚未开发。作者在不同条件下研究了β-PhF5−Ser衍生物3aa和Ac-L-半胱氨酸酸5之间的反应。令人高兴的是，3aa和5之间的SNAr在室温和大气气氛下高效进行（20分钟），以90%的分离产率和3.0当量的NaOAc作为基础添加剂以及DMSO（0.1 M）作为溶剂，得到了理想的“点击”产品8aa（表3，条目1）。观察到反应速率非常快，在5分钟后，目标产品在NMR产率上达到了60%，并在10分钟后进一步增加到78%（条目2和3）。其他常用的基础碱（NaOH、K3PO4、Et3N、DIPEA和Tris）和溶剂（CH3OH、CH3CN、DMF、PBS缓冲液和Tris缓冲液）除了NaOAc和DMSO之外，都导致了较低的产率（条目4−6）。对照实验揭示了NaOAc在促进高效转化中的关键作用（条目7）。产率随着浓度的降低而降低（条目8）。值得注意的是，PhF5 Ala和Cys硫醇之间的反应也进行得很好，在20分钟后提供了96%产率的理想产品（条目9）。此外，PhF5 Ala在“标准条件II”下与PMBSH高效反应，产率非常好，这与需要更严格条件的报道方法形成对比（条目10）。

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通过在存在各种带有未保护亲核侧链的氨基酸的情况下进行反应，来检验这种新合成方法的功能团耐受性，因为这些氨基酸可能与Cys作为亲核试剂竞争。如图4所示，Tyr（酚类）、Trp（吲哚）、His（咪唑）和Lys（胺）的存在基本上对Cys（硫醇）和ArF之间的SNAr没有影响，并且氨基酸在反应结束时可以几乎定量地回收。基于在反应中观察到的独特化学选择性，作者假设可以使用该方法实现Ser和Cys残基之间的未保护肽的非对称多氟芳基装订。

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为了评估已建立方法在设计肽的非对称装订中的适用性，作者合成了肽11a，其中包含一个βPhF5−Ser残基以进一步优化反应条件。令人高兴的是，β-PhF5−Ser残基和Cys残基的装订在DMSO中高效进行，在10当量的NaOAc存在下，在空气中9分钟内迅速完成。将溶剂更换为DMF也促进了这种转化，尽管速率较低（2小时）。其他碱，如K3PO4（92%产率）、DIPEA（62%产率）和Et3N（53%产率）也对装订反应有效。在确定了最佳条件后，继续合成了一系列多氟芳基Ser类似物，以研究装订反应的普适性。如图3C所示，Ser残基和Cys残基之间的SNAr在广泛的未保护肽底物中都有效，以统一的优异HPLC产率产生了非对称装订肽（12a-h，85−98%）。肽中除了Cys硫醇之外的其他亲核基团并没有阻碍反应的进展。此外，多氟芳基Kemptide 7ma和肽NH2-Glu-Cys-Gly-CONH2的分子间反应也展示了高效的进展，产生了期望的产品12i，HPLC产率超过98%。值得注意的是，装订反应也可以在固相上进行，其中11g在树脂上转化为12g，产率为54%。在尝试使用含有Cys残基的未保护肽底物进行多氟芳基化时，反应仅在Cys硫醇处发生，表明多氟芳基化和随后的装订不能在一锅法反应中实现。

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成功保留“羟基”作为装订基团中的手柄，为通过引入有用的治疗功能对装订肽进行后续外环修饰提供了有希望的机会。通过半制备色谱分离得到的环肽12a的两个非对映异构体12a-I和12a-II，通过结合缩合试剂HOBT和EDCI、有机碱（NMM）和装订肽，可以轻松合成标记产品14aa−14ad，产率中等到良好（图3E）。例如，引入了含有叠氮官能团的聚（乙二醇）（PEG）标签（14aa，HPLC纯化后38%）或极性基团（14ab，HPLC纯化后46%）。这些标签可以分别通过点击化学或酰化进一步连接小分子药物。还附加了脂质标签（14ac，HPLC纯化后40%），以潜在地增强肽的细胞穿透性和血浆半衰期。最后，引入了荧光染料（14ad，HPLC纯化后32%），用于细胞内肽的荧光可视化。值得注意的是，对Ser −OH的酯化反应表现出与其他亲核侧链，特别是Lys和Thr的受限兼容性，这是由于亲核缩合反应的内在特性，以及推断的相对反应顺序为Lys > Ser > Thr。因此，需要在Lys和Thr残基脱保护之前进行酯化。

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为了评估装订肽的蛋白酶稳定性，作者制备了装订肽15b及其线性前体15a（图4A）。经过胰蛋白酶和糜蛋白酶处理后，HPLC分析显示，与未装订的前体15a相比，装订肽15b的蛋白酶稳定性显著增强（图4B）。值得注意的是，酶解发生在15b中未装订区域的C末端侧。随后，作者研究了装订肽的细胞穿透性。选择性地将荧光体（5-FAM）连接到C末端的Lys，以追踪细胞穿透和定位（图4A）。这些肽与NCIH1975细胞共孵育4小时，浓度为50 μM，并使用共聚焦显微镜进行分析（图4C）。虽然未装订的肽16a主要定位在膜上，并且在细胞质区域少量定位，但装订肽16b表现出不同的模式，主要定位在细胞质和核区域（绿色荧光雾，见支持信息）。计算结果表明，与未装订的对应物相比，装订肽16b对HIV-CA蛋白的亲和力增强。这种增加的亲和力可能归因于装订肽和HIV-CA蛋白之间更牢固的相互作用，特别是通过增强的疏水作用。使用Rhodamine B（14ad）后期标记的装订肽用于细胞内荧光可视化。与NCI-H1975细胞共孵育4小时后，浓度为50 μM，14ad观察到在细胞质和核区域定位（图4D，红色荧光雾）。肽序列、电荷和装订类型被认为是影响细胞穿透的关键变量。设计两亲模式已成为增强内吞摄取和释放的有希望的策略。作者假设，该装订肽增加的细胞穿透性可能归因于增强的稳定性和抗蛋白酶降解性，以及由装订基团中的疏水C6F4交联引入的增加的疏水性。

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