12-31元大环肽合成妙招！钯催化的sp3 C-H芳基化反应，@Nature Chemistry
文摘
科学
2024-06-17 08:44
四川
从简单的线性前体构建复杂的分子架构，大环化是自然界最强大的手段之一。在大环天然产物中，基于肽的大环表现出最广泛的结构多样性和生物功能，例如抗生素万古霉素、抗癌药物奥曲肽和免疫抑制剂环孢素等。大环肽的大尺寸和扩展的表面可能使它们能够独特地与挑战性的生物靶标，如蛋白-蛋白相互作用进行相互作用，这些靶标对于遵守Lipinski规则的小分子药物来说难以介导。然而，与小分子的合成方法相比，目前构建具有良好定义结构特征和药物样性质的大环肽的方法非常有限。本期小编就给大家介绍一种通用的方法，使用钯催化的8-氨基喹啉（AQ）定向的sp3杂化C-H键芳基化反应，从简单的线性肽前体合成环烷支撑的大环肽（12-31元大环）。这种方法高效、操作简单，并且对肽链的大小和组成的耐受性较好。一种多样的缩合和取代反应，如酰胺偶联、SN2和SNAr，已经成功地用于实现多肽大环化。金属催化的转化，如叠氮-炔烃环加成和关环烯烃复分解，也提供了宝贵的手段来构建各种类型的固定化环肽。尽管这些大环化方法能够获得一系列环肽框架和/或稳定某些肽序列的天然二级结构，它们通常无法控制环化产品的总体三维结构，这往往依赖于弱的分子内非共价相互作用，如氢键。这种依赖于肽组成和由此产生的弱相互作用极大地阻碍了新型肽宏观环的研究。虽然在环肽天然产物中最常见的是酰胺、酯或二硫键交联，但大自然也使用基于酶催化的化学惰性碳-氢键（C-H）官能团化策略，这些C-H键位于芳香性和/或脂肪族氨基酸残基的侧链上，以环化线性肽前体，形成复杂且具有生物活性的天然产物，如万古霉素、头孢菌素和链肽。在这些“C-H交联”的宏观环中，芳香侧链嵌入大环的主链中，形成一个环芳烃型的框架。由于芳香平面的刚性和大的跨环应变，所形成的框架可能采用独立于氢键相互作用的受限构象。这种刚性的三维结构和环烷连接链的疏水性也可能有助于这类环肽天然产物的新生物功能。受到这些结构的启发，作者质疑是否可以利用环烷元素通过C-H官能团化化学生成新的环肽结构。反应条件探索：尽管金属催化的导向基团控制的C(sp3)–H官能团化反应的化学在近年来已经被广泛研究，但其在复杂分子合成中的应用仍然具有挑战性。在报道的C(sp3)–H官能团化反应中，钯催化的AQ定向的β-甲基C–H芳基化可以在分子内方式进行，以合成简单的小尺寸苯并融合环。当前的机理模型提出，底物N-喹诺烷基烷基酰胺首先在β位置发生C–H钯化，形成一个五元钯环中间体。这个钯环中间体与芳基碘化物发生C–H官能团化过程，导致分子内C–C偶联，提供环化产物。然而，通过这种催化方式合成肽大环将面临分子内与分子间竞争、肽酰胺基团对C–H活化过程的干扰、肽骨架的构象以及开发肽相容的反应条件等挑战。如下图所示，评估了三肽AQ-Sub-Leu-Gly(m-I)Phe-OMe (1)的环化反应，该三肽具有间碘化的Phe残基((m-I)Phe)和AQ封端的癸二酸(Sub, 8个碳)的烷基尾在N端。1可以从容易获得的氨基酸构建块中快速组装，使用固相或液相肽合成程序。在优化的条件下，1的环化反应顺利进行，以优秀的产率给出了18元的环烷产物2，作为1:1的非对映异构体混合物。LC-MS分析显示，肽2没有检测到可察觉的外消旋。使用5 mol%的Pd(OAc)2在5 mM浓度下，获得了2的72%分离产率（基于1H-NMR分析的粗反应混合物的78%），并且<5%的36元二聚体副产物2d（条件C）。通过LC-MS分析，没有检测到其他显著的产物（>2%）。将反应浓度从5增加到25 mM给出了非常相似的结果（条件B）。在100 mM浓度下，获得了2的49%和2d的16%（条件F）。使用2或10 mol%的Pd(OAc)2也给出了类似的结果（条件A，D）。oPBA添加剂在促进这种AQ定向的分子内C–H芳基化反应中是独特的有效。在条件C下，使用0.5当量的PivOH或AcOH分别给出了2的44%和31%的分离产率。![]()
底物适用范围：使用优化好的条件，接下来探索了这种钯催化的肽环化方法的底物适用范围（见下图）。所有线性肽前体，只要在其侧链上含有碘化的Phe、Tyr和Trp单元，都可以使用标准的固相、液相或联合相合成仪快速制备。值得高兴的是，这种方法能够快速地将这些线性肽前体环化，形成各种环烷支撑的肽环。这种策略为我们提供了一个强大的工具，以解决肽大环化中长期以来存在的尺寸和组成依赖性的挑战，并生成具有独特支撑的骨架和明显环型三维结构的新型肽大环。该方法对肽组成表现出显著的耐受性，大环的尺寸、环烷连接链的几何形状、以及烷基尾的选择。在该系统中，通常用于大环肽中的转折单元Pro并不需要就可以实现高效的环化。在5 mM浓度（条件C、D）下，二聚体副产物通常少于5%的产率。在条件C下，携带D-或L-Val单元的非对映异构体metacyclophane产物5和6在相似的产率下获得。还可以兼容含有叠氮烷基侧链的底物（见化合物7）。在更紧张的拓扑结构中，例如para-cyclophane产物4和10，在10 mol%的Pd催化剂（条件D）下能以良好的产率得到。在Tyr或Trp侧链上的环化同样效果很好（见化合物11、12）。各种保护的氨基酸单元，如Arg（13）和Lys（14）被很好地容忍。未保护的氨基酸单元，如Ser（11）、Thr（14）、Trp（14）和Met（15）也可以使用。除了癸二酸（Sub，C8），其他烷基二酸如己二酸（Adi，C6，见化合物4）、庚二酸（Pim，C7，见化合物12）和十一烷酸（Aze，C9，见化合物14）也可以顺利地进行。值得注意的是，丁二酸（C4）和戊二酸（C5）未能产生任何产品，可能是由于肽的末端酰胺基团通过形成动力学上更有利的5或6元Pd复合物抑制了C–H活化步骤。一个在C端带有6-氨基己酸（Ahx）尾的底物以良好的产率得到了21元的para-cyclophane 10。模仿链肽的7'-Trp连接的核心结构的22元环化合物12以71%的产率获得。带有保护的RGD序列的25元化合物para-cyclophane 13以61%的产率获得。模仿奥曲肽序列的26元化合物14以66%的产率获得。具有混合肽骨架的37元化合物15以特征性的混合肽骨架获得。值得注意的是，所有产物都作为非对映异构体混合物在β碳上得到。非对映异构体比例通常接近1:1；也观察到较大的比例，如1.6:1（化合物10）。一些非对映异构体可以通过硅胶色谱分离。这些环化反应通常进行得很干净，除了少量的二聚体副产物外，几乎没有形成其他副产物。与柔性的酰胺、酯或二硫键连接相比，环烷基团能够为不同大小的大环肽骨架提供更坚固的支撑，形成稳定且扩展的三维结构。如图2所示，我们的许多大环肽（例如3、11、17）通过X射线晶体学显示出高度的构象稳定性。例如，16元环的para-环烷基形成一个带有线性对二甲苯脊柱的D形环。21元环的大环肽骨架特征是一个突出的meta-环烷基区域，其余的肽处于一种交错的构象中。![]()
与环化肽中的酰胺连接的AQ辅助基团难以去除。如化合物16所示，5-甲氧基-8-氨基喹啉（MQ）辅助基团41，一个改良的AQ基团，可以在标准条件下以类似的效率促进相同的钯催化环化（见下图）。将16置于轻度氧化剂硫酸铵（CAS）在CH3CN和H2O中于50°C下处理，可以干净地切割MQ基团，以良好的产率得到游离酰胺产物17。如下表所示，肽底物也可以在非芳香族氨基酸单元上进行环化，这些单元带有假体碘芳基取代基。通过酯、酰胺或醚连接，Ser、Glu和Lys的侧链可以很容易地修饰各种碘芳基团，提供类似芳香族氨基酸构建块。这些被纳入线性肽前体中，使用相同的合成步骤。例如，底物18在4'-碘苯甲酰基保护的Ser（(4'IBz)Ser）单元处进行环化，以75%的产率在一般条件D下形成产物19。化合物20-22通过在Ser上的3'-碘苯甲酰基团进行环化，以优异的产率得到。通过在Ser上的6-碘萘磺酸盐、4-碘苯酚醚、Glu上的3-碘苄酯、Glu上的4-碘苯胺酰胺和Lys上的3-碘苯甲酰胺进行环化，分别得到产物23-27。使用这种方法还可以制备具有显著环张力的小尺寸环烷（下图）。例如，AQ-Sub-(p-I)Phe-OMe 28的环化在标准条件D下以62%的产率得到了13元环的para-环烷29，同时产生的二聚体副产物29d不到5%。通过硅胶色谱分离了29的两个非对映异构体；它们的结构通过X射线晶体学得到了确认。29的计算环张力为7.7 kcal mol–1。X射线分析显示，29的对二甲苯平面略有弯曲，两个苄基碳原子相当程度地扭转出了芳香平面（α = 6.5°，β = 9.0°）。与28的分子内C–H芳基化容易进行形成对比，传统的前体30的大环内酰胺化在各种酰胺偶联条件下（例如HATU/DIPEA）只产生了微量的29（<5%），据推测是由于显著的环张力。从带有庚二酸（Pim，C7）尾的(p-I)Phe衍生底物制备了12元环的para-环烷31（计算环张力：12.1 kcal mol–1），产率为23%，同时产生的二聚体副产物31d为51%。同样，12元的para-环烷32以21%的产率得到。X射线分析显示，31和32的苯环进一步弯曲（α > 8°，β > 11°）。据我们所知，化合物31和32是迄今为止合成的一些最具张力的para-环烷。合成11元环的para-环烷的尝试未能成功。如化合物33和37所示，在标准条件D（5 mM）或E（25 mM）下，从(m-I)Phe衍生的底物高效合成了拓扑上不那么紧张的meta-环烷。AQ-Pim-(5'I)Trp-OMe的环化在条件E（25 mM）下以87%的产率得到了12元环的34。如下图所示，38中的MQ基团可以通过CAS处理轻松去除，在温和条件下得到39。生物测试：为了评估上述制备的大环肽的生物活性，作者对几种与Myc47（髓细胞瘤病毒癌基因同源物）相关的癌症细胞系进行了筛选，包括依赖Myc的早幼粒细胞白血病细胞HL-60和急性髓细胞性白血病细胞KG1a，不依赖Myc的肝癌细胞HepG2，以及工程化的Burkitt淋巴瘤细胞P4936（Myc的表达和增殖严格受四环素（Tet）调控，作为Tet-on或Tet-off）。原癌基因Myc在细胞增殖、分化和凋亡中发挥关键作用；针对Myc特有途径的小分子靶点仍然难以捉摸，且可能为癌症治疗提供新策略。令人兴奋的是，在35种化合物中的3种（8、16、21）发现了显著的活性，其IC50s小于10 μM（下表）。与此相比，其余的化合物显示出较弱的活性（IC50s大于20 μM，这是我们筛选实验中使用的最高浓度）。在这三个化合物中，21对依赖Myc的HL60、KG1a和P4936 Tetoff细胞系以及不依赖Myc的P4936 Tet-on、HepG2细胞系具有最高的细胞毒性。有趣的是，8在增殖的依赖Myc的癌细胞中显示出强烈的抑制作用，但在非增殖的不依赖Myc的癌细胞中完全无效，表明其可能具有Myc特异性的细胞毒性效应。从结构-活性关系的角度来看，8、16和21的环状支架对发挥细胞毒性活性至关重要，因为它们的线性肽前体48、49和50基本上是无效的。与8相比，9在Phe残基上多了一个Cα酯基团，显示出很少的活性。从16与4以及21与51的比较来看，用MQ基团替换AQ基团并没有显著改变活性。从52来看，用未盖帽的初级酰胺替换21中的AQ基团大大减少了其活性，这表明疏水性AQ基团对于它们与潜在靶点的结合是重要的。总的来说，作者通过这种方法获得的中等大小的大环肽（小于19个成员）显示出良好到优秀的细胞膜渗透性（-log(Pe)小于6.0）。例如，1与2和16与49的比较表明，环化显著提高了肽的渗透性。相比之下，更大尺寸的大环肽（大于19个成员，参见21、8和11）显示出较差的渗透性。此外，疏水性氨基喹啉辅助基团有利于膜的渗透性（16与17的比较）。
实验操作：Typical procedure for synthesis of peptide macrocycles via Pd-catalysed AQ-directed C–H arylation under conditions C：
A mixture of linear peptide substrate 1 (76 mg, 0.1 mmol, 1.0 equiv), Ag2CO3 (22 mg, 0.08 mmol, 0.8 equiv), oPBA (10 mg, 0.05 mmol, 0.5 equiv), and Pd(OAc)2 (1.1 mg, 5 μmol, 0.05 equiv) in tBuOH (20 mL) in a 40 ml glass vial sealed with a PTFE cap, was heated at 100 °C for 12 h (air and moisture were not vigorously excluded). After being cooled to room temperature, the reaction mixture was diluted with ethyl acetate (50 ml) and filtered through a short pad of celite. The filtrate was concentrated in vacuo. The residue was dissolved in dichloromethane (DCM, 50 ml), and washed with a saturated aqueous solution of sodium bicarbonate. The organic phase was dried over anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated in vacuo. The resulting residue was purified by silica gel flash chromatography to give the cyclized product 2 as a white solid in 73% yield (Rf = 0.4, 5% CH3OH in DCM, where Rf is the retardation factor).
