天然肽的后期多样化可点击色氨酸修饰，包括SCF3、SCF2H、SCF2CO2Et、SAlkyl/SAryl等基团的高效引入！

文摘 2024-09-03 09:00 四川

色氨酸（Trp）是肽和蛋白质中独特的残基。由于色氨酸的生物合成是20种标准氨基酸中最耗能的过程，因此色氨酸在蛋白质中的含量最低（约1%）也就并不意外。色氨酸由一个密码子UGG编码，没有冗余，并且总是在功能位点富集，这表明只有在绝对需要时才会引入色氨酸。由于具有最大的平面富电子π系统，色氨酸通过多种相互作用在蛋白质的生物活性和生物物理性质中发挥关键作用，不仅仅是简单的疏水效应。它通过链内和链间阳离子-π相互作用分别有助于稳定二级结构和蛋白质-蛋白质相互作用，并通过π-π堆叠效应稳定蛋白质-小分子相互作用（图1A）。在蛋白质组之外，色氨酸也经常出现于不同来源的生物活性肽中（图1A），包括核糖体合成和翻译后修饰的肽（RiPPs，例如darobactin和tryptorubin A）以及肽激素（例如生长抑素和促性腺激素释放激素）。就像在蛋白质中的情况一样，色氨酸在配体-受体相互作用中的多种贡献使得其在天然产物或本土激素衍生的肽类药物中不可或缺（例如vapreotide和tirzepatide）。此外，色氨酸还积极参与肽类药物的酶促降解，例如通过胰蛋白酶。作为新药中增长最快的类别，肽类药物目前正作为中等大小的治疗剂出现，以解决未满足的医疗需求，这得益于它们与小分子药物和生物制剂相比的内在生化和物理特性。自1923年胰岛素开发以来，已有100多种肽类药物获得FDA的批准上市，其中约40种药物用于治疗各种疾病（例如癌症、心血管疾病和代谢疾病），至少含有一个色氨酸残基。嵌入肽类药物中的色氨酸残基的化学修饰不仅可以调节药物-靶标相互作用，还可以提供改善药物稳定性、生物利用度和药代动力学的机会。通过位点选择性的后期修饰在全长侧链未保护的肽上快速生成色氨酸修饰药物类似物，尤其是通过结构多样化的方式，无疑是一个吸引人的目标。色氨酸具有独特的化学性质，包括吲哚环的低芳香性和软亲核性，这为开发色氨酸选择性转化提供了基础。

尽管选择性修饰色氨酸的o-硝基苯磺酰氯可以追溯到1960年代，但在过去十年中，色氨酸选择性修饰反应的发展迅速。通过采用张等人提出的晚期芳香族C─H键官能团化的四个标准，作者定义了有效的后期色氨酸修饰为满足以下五个规则的反应：

高反应性，有助于在40°C或更低温度下顺利转化；
高位点选择性，确保只有色氨酸被修饰，无需辅助；
高化学选择性，生成良好定义的结构，无异质性；
广泛的底物范围，允许任何未保护的肽（线性和环状）无论序列、侧链功能和物理化学性质如何都能反应；
溶剂能够溶解任何未保护的肽。

在肽修饰的情况下，溶剂问题值得注意，因为肽底物通常在许多有机溶剂中溶解度差（例如，二氯甲烷、二氧六环和木酚），而这些溶剂却常常有利于过渡金属催化的官能团化。一系列后期色氨酸选择性修饰已被发现满足这些五个规则中的一些（图1）。大多数反应通过形成C─C、C─N或C─S键生成C2修饰产物，而通过N-烯胺形成、Cβ-H烷基化和去芳香化的修饰也有报道。从机理上讲，通过化学/电化学/光化学过程引发的自由基反应是主导的，因为它们与水溶剂系统和侧链及主链中的酸性质子兼容。基于极性过程的反应，其中吲哚作为软亲核体的反应较少发展，因为其他侧链亲核体和溶剂的竞争对反应设计提出了巨大挑战。通过试剂设计刻意平衡反应性和化学/位点选择性，并将溶剂作为额外的调节因素将是成功的关键。

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本期小编就给大家介绍香港大学化学系李学臣教授最新报道的一种用于后期多样化天然肽（包括市场上的肽类药物）的可点击色氨酸修饰的方法，通过使用S-取代的8-喹啉亚磺酸盐作为亲电硫供体，在三氟乙酸（TFA）条件下进行无催化剂的亲电C2-亚磺酰化（图1C）。在这种策略中，TFA作为肽溶解和试剂激活的通用溶剂。通过这种策略，一系列从吸电子的SCF3/SCF2H到给电子的SAlkyl/SAryl的官能团都被高效地安装，这写都可用于调节生物活性肽的生物活性和药代动力学性质。（Sci. Adv. 10, eadp9958 (2024)）

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基于后期C2-亚磺酰化的可点击色氨酸修饰的方法建立

三氟甲硫基（-SCF3）被认为具有较大的亲脂性（π=1.44）和强大的电子吸引能力（σm=0.40和σp=0.50），这可以提高药物的代谢稳定性和膜透过性。二氟甲硫基（-SCF2H）呈现出中等亲脂性（π=0.68），被认为是高亲脂性的弱氢键供体，也为药物结构优化提供了可能性。当模型肽2a与试剂1a（PhSO2SCF3）反应时，在所有条件下都没有观察到色氨酸修饰产物3a。为了进一步提高SCF3的亲电性，测试了含有喹啉结构的试剂4（QSO2SCF3，Q=喹啉基），它已在文献中合成，但没有测试其反应性。高兴的是，通过广泛的条件筛选，最后观察到当肽2a用4（50 mM）在TFA中处理时，实现了色氨酸修饰肽3a的快速和清洁转化（条目1，图2A）。通过纯化化合物的核磁共振（NMR）分析确认了3a的结构，其中吲哚环C2上的质子信号消失了。发现使用TFA作为溶剂对成功至关重要，而将溶剂更换为酸性较弱的HOAc（pKa，4.76）或强氢键供体如2,2,2-三氟乙醇（TFE）和1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇（HFIP）则没有转化（条目2至4）。向TFA中添加水（5% v/v）部分耐受，但25% v/v水导致转化率大大降低（58%）（条目5至6）。在其他TFA/有机溶剂混合物的情况下，将TFA/TFE比例从9:1变化到3:1和1:1（ v/v），转化率分别降低到74%、70%和42%，而TFA/二甲基亚砜（DMSO）和TFA/N,N'-二甲基甲酰胺（DMF）混合物（1:1，v/v）则完全抑制了反应（条目7至11）。作者还测试了肽2a与试剂1b至1d在TFA中的反应，只有带有吸电子的4-NO2取代基的1d给出了中等的29%转化率（条目12至15）。

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TFA很少用作有机反应中的溶剂，除了酸性去保护外，但在未保护肽修饰中非常有益，因为它具有最强的变性能力，几乎可以溶解任何肽序列，即使具有高亲脂性和聚集倾向。在Strömberg的肺表面活性蛋白-C的O/S-选择性棕榈酰化中，TFA被用作溶剂，完全溶解了带有2个棕榈酰基团的疏水蛋白，并完全抑制了Lys和Arg侧链上不希望的酰化。在该反应中，使用TFA允许高肽操作浓度（10 mM），这使得后期修饰易于放大。在TFA中的出色表现可能归因于TFA与喹啉环之间的H-键相互作用，增强了SCF3基团的亲电性。在我们的NMR滴定研究中，通过逐渐增加TFA/4摩尔比从1.3:1到25:1，明显观察到1H和19F信号的场下移，而在50:1比例下没有进一步的移动（图2B）。基于这个结果，以及未能获得4-TFA盐晶体进行X射线衍射分析的尝试，作者提出这里的H-键相互作用是非常动态的，并且浓度依赖的，这也可以理解为什么TFA必须作为溶剂而不是添加剂使用，没有其他H-键受体（DMSO或DMF）。为了进一步确认喹啉而不是磺酰基团在H-键相互作用中的重要作用，我们对1d进行了NMR滴定，观察到1H和19F NMR中没有信号移动。

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可点击色氨酸修饰的底物范围

有了优化的条件，接下来考察了试剂4对一系列含有色氨酸的模型肽进行色氨酸选择性C2-三氟甲硫基化的底物范围和限制。这些模型肽具有随机序列或来源于如促红细胞生成素、脂联素和白细胞介素-25等蛋白质（图3）。含有未保护的所有20种氨基酸的模型肽2a至2o在色氨酸残基上被三氟甲硫基化，具有令人满意的高效液相色谱（HPLC）分离产率，范围从43%到83%（3a至3o）。在反应过程中，芳香侧链残基，包括酪氨酸和苯丙氨酸，都未受影响（3b、3e和3f等）。可以想象，在TFA中，Ser、Thr、Lys、Arg、Asp、Glu和His的极性侧链的亲核性被抑制，并在我们的条件下很好地耐受。此外，敏感的氨基酸Met（3d和3j）和Cys（3k和3l）与反应兼容。没有观察到Met的S-亚磺酰化或肽裂解，而通过Cys侧链和试剂4在该条件下的反应形成的亚磺酸盐（S-SO2Q）和二硫化物（S-SCF3）在用过量的还原剂[三（2-羧乙基）膦（TCEP），500 mM水溶液]处理后，很容易还原回游离的Cys。作者合成了S-二氟甲基化（SCF2H）和S-（乙氧羰基）二氟甲基化（SCF2CO2Et）的含有喹啉的亚磺酸盐（5a和5b），并在标准条件下测试了肽2a的后期修饰。试剂5a在标准条件下促进了C2-二氟甲基硫基化，与试剂4的效率相似，并以76%的产率得到了3p，而5b在中等48%的产率下得到了3q，其中安装的酯基在温和酸性条件下定量水解为羧酸。受到这一鼓励，作者进一步探索了S-烷基化的喹啉-含有亚磺酸盐试剂，锚定了包括简单甲基（6a）和多种官能团，包括羧酸（6b）、醇（6c）、叠氮化物（6d）和炔烃（6e）在内的反应。在最佳条件下，所有情况下都获得了中等到极好的分离产率（3r至3v）。该结果与在Lewis酸催化下简单吲哚分子的报道案例不同，其中在3-甲基吲哚底物上没有发生C2-亚磺酰化，这展示了TFA溶剂的关键活化效应。对于S-芳基化试剂6f和6g，修饰肽3w和3x分别以68%和66%的产率分离，这与最近报道的基于自由基光催化的色氨酸选择性C2-芳基亚磺酰化相当。

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肽药物的后期多样化在模型研究中，后期色氨酸选择性C2-亚磺酰化显示出广泛的底物范围，完全的侧链耐受性和S-取代多样性。包括电子吸引的SCF3/SCF2H基团和电子供体的SAlkyl/SAryl都可以无偏见地安装。接下来，将研究转移到更复杂的结构的市场上的治疗肽和生物分子的修饰。由于TFA的超级溶解能力，所有肽底物都在10 mM浓度下进行了修饰。如图4所示，标准条件下对带有二硫键的大环肽药物的后期修饰，如生长抑素7（1.4 kDa，1 Trp）、奥曲肽8（1.0 kDa，1 Trp）、兰瑞肽9（1.1 kDa，1 Trp）和赛美拉肽10（1.1 kDa，1 Trp），提供了带有氟化（SCF3和SCF2H）或非氟化[SMe，S(CH2)5COOH和S(4-Cl-Ph)]取代基的C2-亚磺酰化产物，产率良好，二硫键保持完整。在大环脂肽抗生素达托霉素11（1.6 kDa，1 Trp）的情况下，与试剂4的反应在10 mg规模进行，以68%的产率获得了三氟甲基硫基化类似物11a 13.2 mg。达托霉素中的非蛋白质氨基酸犬尿氨酸（Kyn）和鸟氨酸（Orn）与反应完全兼容。对于长线性肽药物，通过试剂4、5a和6a修饰了长效胰高血糖素样肽-1受体激动剂塞美格鲁肽12（4.1 kDa，1 Trp）和依赖葡萄糖的胰岛素促进多肽类似物tirzepatide 13（4.8 kDa，1 Trp）。由于长脂肪链修饰在Lys上的产率没有侵蚀（49%至93%），因此没有造成产率下降。此外，线性促性腺激素释放激素肽类药物如亮丙瑞林14（1 Trp）、组培瑞林15（1 Trp）和曲普瑞林16（2 Trp）通过试剂4、5a和6a顺利修饰，所有色氨酸残基上都进行了C2-亚磺酰化。作为一个特殊情况，戈舍瑞林17（1 Trp）上的D-Ser6的叔丁基在TFA条件下被移除，产生了修饰产物17a和17b。在修饰成像诊断剂前体DOTA-GGNle-CycMSHhex 18和DOTA-TATE 19时，需要延长反应时间以获得高转化率。

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为了进一步探索这种方法的边界，探索了来自人脂联素胶原域的生物活性糖肽hAdn-WM6877 20的后期修饰。肽20（7.4 kDa，69个氨基酸）含有两个O-糖基化的羟赖氨酸残基，在作者的最近研究中显示出有希望的抗癌和调节代谢活性，其中发现糖基化是不可或缺的（71）。将20与1.2当量的试剂4在10 mM浓度的TFA中在30°C下处理1小时，得到了在N-末端色氨酸残基上进行C2-SCF3修饰的产物21，产率为53%，这证明了与O-糖基化的兼容性（图5）。允许在1小时内完全转化的快速反应动力学在这种情况下是有益的，因为在TFA中延长反应时间可能会导致不稳定的糖苷键的裂解。

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通过后期色氨酸修饰提高melittin的血清稳定性用于药物开发的天然生物活性肽在体内评估期间总是遇到血清稳定性差和膜透过性差的问题。已经证明三氟甲硫基（SCF3）和二氟甲硫基（SCF2H）基团是改善生物活性小分子药代动力学性质的有前途的修饰，它们也可能对肽分子产生类似的效果。为了研究色氨酸选择性C2-SCF3和SCF2H修饰对生物活性肽药代动力学性质的影响，作者选择了melittin 22作为我们的目标。Melittin是一种含有26个氨基酸的短生物活性肽（序列H-GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH2），存在于蜜蜂毒液中，占毒液干重的40至60%。除了引起疼痛感外，melittin的生物活性还包括抗菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生虫和抗癌效果。Melittin在黑色素瘤、非小细胞肺癌、白血病、卵巢癌、宫颈癌、胶质母细胞瘤和胰腺癌等多种癌症治疗中的抗癌活性已得到证实。目前，melittin正在进行许多癌症治疗的临床试验。然而，极短的血浆半衰期以及非特异性毒性限制了它的治疗用途。通过该色氨酸选择性后期修饰方法，获得了C2-三氟甲基硫基化melittin-SCF3 23a和C2-二氟甲基硫基化melittin-SCF2H 23b，产率分别为69%和58%（图6A）。在细胞毒性测定中，类似物23a和23b与天然melittin 22在人表皮生长因子受体2（HER2）富集的乳腺癌细胞系（SKBR3）和三阴性乳腺癌细胞系（MDA-MB-231）上显示出可比的效力，这证明了生物活性未减弱。在乳腺癌细胞系（MCF7）中，23a显示出比22更高的活性，这展示了SCF3基团引起的增强的膜干扰效应（图6B）。在体外人血清降解测定中，惊讶的是，将SCF3和SCF2H基团引入Trp19大大改善了血清稳定性，并延长了半衰期从8小时到超过24小时（图6C）。分析表明，对Trp19的修饰在很大程度上阻止了血清肽酶催化的在邻近的Arg24-Gln25位点的裂解。

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肽逐渐作为中等大小的治疗药物出现，以解决未满足的医疗需求，因为它们与小分子药物和生物制剂相比具有内在的生化特性。自1923年胰岛素开发以来，已有100多种肽类药物获得FDA批准，用于治疗包括抗癌、心血管疾病和代谢疾病在内的广泛疾病。在这方面，后期结构修饰的本土肽和肽类药物可以轻易地增加结构和功能多样性，并通过改善它们的稳定性、生物利用度、药代动力学和药效学，以及实现靶向输送和减少免疫原性，从而显著提高它们的治疗潜力。实现对功能密集分子的转化需要高水平的选择性（即化学选择性、区域选择性和立体选择性）。天然肽带有各种亲核官能团（例如，硫醇、胺、羧酸等），对氧化还原条件敏感，而且用于溶解未保护肽的溶剂也是有限的。因此，开发位点特异性的晚期肽修饰是一项艰巨的任务。

该方法实现了通过使用S-修饰的喹啉-含有亚磺酸盐试剂进行无催化剂的晚期C2-亚磺酰化，实现可点击色氨酸修饰的方法。包括三氟甲基硫基（SCF3）、二氟甲基硫基（SCF2H）、（乙氧羰基）二氟甲基硫基（SCF2CO2Et）、烷基硫基和芳基硫基团在内的多种官能团可以高效地安装在天然肽的色氨酸残基上。在这种转化中，TFA被用作最佳溶剂，并通过H-键相互作用在试剂活化中发挥了重要作用。此外，TFA对疏水和聚集倾向肽的超级溶解能力确保了这种方法适用于像脂肽和自组装肽这样的困难分子，可以在相对较高的浓度下进行。这种方法成功地应用于几种市场上的肽类药物以及生物活性糖肽hAdn-WM6877的晚期修饰，展示了这种方法在肽类活性药物成分的多样性定向修饰中的适用性。我们相信，这种单步骤可点击的后期色氨酸修饰方法将为以成本效益高的方式生成结构类似物提供一个强大的平台，以满足优化药物活性和药代动力学属性的需求，并将成为药物化学家、肽化学家和化学生物学家宝贵的工具。

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