肽类先导化合物结构优化策略《三》：如何提高肽类分子的渗透性和水溶性

3 提高肽类分子的渗透性

除了少数疏水肽, 大部分多肽都具有极性侧链; 同时, 多肽分子中的肽键可以与水分子形成氢键。因此, 大部分多肽都具有很好的水溶性。而多肽药物必须透过细胞膜才能吸收入血, 发挥药理学活性。因此, 必须要对多肽进行结构修饰与改造, 提高肽类分子的渗透性, 以利于多肽分子进入细胞, 发挥活性。提高肽类分子渗透性的方法包括引入卤素原子、去除极性侧链、手性策略、N-烷基化、高级脂肪酸修饰和其他方法等。

3.1 引入卤素原子

在小分子药物的化学修饰中, 往往采用引入卤素的修饰策略以提高小分子药物的亲脂性。在肽类分子的修饰改造中, 卤素的引入也可以提高肽类分子的脂溶性。神经多肽内吗啡肽具有很强的镇痛活性, 然而内吗啡肽57作为一种肽类分子, 很难通过血脑屏障进入大脑发挥药效。通常药物分子进入血脑屏障需要一定的亲脂性, 兰州大学王锐等采用了引入卤素原子的策略, 将2位脯氨酸变换为D-丙氨酸, 4位苯丙氨酸上引入卤素以提高整体肽分子的脂溶性^[50], 通过该策略可以明显提高内吗啡肽类似物的渗透性, 可以通过血脑屏障。内吗啡肽57的脂水分配系数D仅有12.5, 而引入卤原子, 内吗啡肽类似物的D值上升至120, 提升了近9倍(图 21)。通过动物实验, 脑实质中检测到了肽77, 进一步验证了通过引入卤素原子可以使肽类分子通过血脑屏障^[51]。

3.2 去除极性侧链

肽类分子中常含有极性的羧基片段, 这些富含谷氨酸和天冬氨酸的肽细胞渗透性比较差, 针对这类肽分子的改造一般采用去除极性侧链的策略。一方面, 去除极性侧链可以缩小肽分子的尺寸, 降低肽链多肽的性质, 使其更具有类似有机小分子的性质; 同时也可以改善肽类分子的细胞渗透性, 有利于其进入细胞发挥药效。比较典型的案例就是抗丙肝病毒药物特拉匹韦的研发(图 22)。Vertex公司早期发现了底物十肽78的活性为0.89 μmol·L^-1, 然而该化合物的分子量大, 需要首先对分子大小进行优化。研究人员考察了去除不同氨基酸片段对化合物抗病毒活性的影响, 研究表明去除P4'氨基酸片段对活性影响较大, 而去除P2'和P3'氨基酸片段对酶的亲和力几乎无影响。去除P5和P6两个含有酸性侧链的氨基酸片段, 活性明显降低。另外, 去除P3和P4两个疏水性氨基酸片段也会导致活性的下降。同时考虑到对丝氨酸蛋白酶的结合能力, 研究人员在C末端引入亲电性的醛基作为弹头, 得到了跨越S6~S1的六肽醛79, 其活性与底物十肽相同, 但是分子量显著降低。

虽然P5和P6两个酸性氨基酸片段对活性很重要, 但是由于两个羧基的存在, 六肽醛79的极性很大, 不利于化合物进入病毒感染的细胞, 因此下一步结构改造的重点是提高分子的透膜性。研究人员进一步切断P5和P6两个氨基酸片段, 并以杂环进行替换得到四肽醛19, 其抗病毒活性明显下降, 但是相比于底物十肽78, 分子量减小一半, 整个分子的成药性更好^[52]。由于醛基的代谢性质较差, 因此醛弹头被其他弹头替换得到酮酰胺化合物20, 其抗病毒活性与稳定性俱佳, 至此, 肽类分子的透膜性问题得以解决。

化合物20的活性仍有提高的空间, 因此研究人员对P1~P4片段进行了系统性优化。他们发现脯氨酸的疏水性基团对酶的亲和力影响很大, 因此首先对P2片段进行改造, 通过比较不同的疏水基团如醚、酯以及氨基甲酸酯等衍生物, 最后得到的含有四氢异喹啉氨基甲酸酯衍生物80, 其对NS3/4A酶的抑制活性提高至0.22 μmol·L^-1。进一步优化P1, 发现S1口袋仅能容纳尺寸较小的疏水性基团, 最终确定乙基侧链为最优; 同时优化P3和P4, 得到的化合物81活性与80相当, 但是81的cLogP (5.5)更符合Linpinski五规则, 因而对81进一步研究。将P2乙基侧链与脯氨酸环化, 进一步考察最终确定化合物82, 其对丙肝病毒NS3/4A蛋白酶的抑制活性为44 nmol·L^-1, 是一个活性很高的丝氨酸蛋白酶抑制剂, 被命名为特拉匹韦^[53]。特拉匹韦于2011年被FDA批准上市, 用于治疗丙型肝炎病毒感染。

3.3 手性策略

环肽类化合物的二级结构与其理化性质和药理学性质密切相关。北京大学深圳研究院李子刚等提出了一种假设——在约束肽的连接链上引入一个手性中心以改变肽类分子的理化性质和二级结构, 从而影响肽类分子的透膜性。为验证这一策略的合理性, 他们设计合成了两条FITC标记的含有手性中心的环肽化合物83和84。由于手性中心的存在, 环肽83和84存在一对非对映异构体, 分离出这些异构体83a/b和84a/b并且将之与HEK293T细胞于37 ^oC共孵育2 h, 用荧光共聚焦显微镜成像(图 23)。研究结果表明, 其中一种构型的异构体83b和84b可以穿入HEK293T细胞, 而另一构型的异构体83a和84a无法穿入细胞。说明手性中心的引入可以使肽的螺旋结构发生变化, 从而影响肽类分子的透膜性^[54]。

3.4 N-烷基化

N-烷基化的酰胺键往往可以改变肽类分子内或分子间的氢键相互作用, 从而影响肽类分子的空间结构进而改变其物理化学性质。柔性肽类分子中的分子内氢键是被动扩散中的决定性因素。通过在特定的酰胺键进行烷基化, 可以使肽类分子以最优势的构象穿过细胞膜^[55]。Beck等^[56]对丙氨酸环六肽进行N-甲基化修饰以考察N-甲基化对丙氨酸环六肽透膜性的影响。实验结果表明, 在1, 5位、1, 6位或1, 2, 4, 5位酰胺氮原子进行甲基化修饰可以明显提高肽类分子对Caco-2细胞的渗透性, 其渗透性与对照睾酮(细胞透膜性标志物)相当。分析1, 6位N-甲基化修饰的环六肽的空间构象发现, 2位酰胺氢与5位酰胺羰基可以形成分子内氢键, 而3位4位氨基酸所形成的β转角也形成了分子内氢键, 整个分子以疏水的构象存在(图 24), 因而细胞渗透性提高。

3.5 高级脂肪酸修饰

提高肽类分子透膜性的常用策略是对多肽进行高级脂肪酸修饰。脂肪酸包括不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸, 目前有一些饱和脂肪酸修饰的多肽药物已经上市用于疾病的治疗, 或者开发处于临床研究阶段。脂肪酸是构成磷脂双分子层以及人体脂肪的重要成分, 因此对多肽进行脂肪酸修饰可以提高多肽与细胞膜表面的亲和能力, 从而提高肽类分子的透膜性, 促进上皮细胞对肽类分子的吸收。Hashizume等^[57]对胰岛素分子的侧链进行棕榈酸修饰, 棕榈酸酰化胰岛素的亲脂性提高。研究人员用同位素标记胰岛素, 并通过测定给药后6 h内血浆中的放射性推断胰岛素在血浆中的含量。结果表明, 双棕榈酰胰岛素的含量最高时是天然胰岛素的6倍, 单棕榈酰胰岛素的含量是天然胰岛素的3倍(图 25)。这也说明高级脂肪酸修饰可以提高肽类分子的透膜性。

3.6 其他方法

除了化学方法, 某些制剂手段也可以影响肽类化合物的渗透和吸收。N-[8-(2-羟苯基)氨基]辛酸钠(sodium N-[8-(2-hydroxybenzyl)amino]caprylate, SNAC)是由Emisphere开发的一种基于各种促吸收剂的大分子递送技术。SNAC能够递送0.5~150 kDa的大分子, 且不会影响大分子的高级结构, 不影响药物释放。同时SNAC还具有很高的安全性, 不影响胃肠黏膜结构。

吸收促进剂与药物分子存在较弱的非共价相互作用, 可形成暂时稳定的中间体。促进剂一般是疏水性物质, 通过与药物分子相互作用形成的药物促进剂复合体具有更强的亲脂性, 从而促进药物分子透过上皮细胞膜。由于复合体只存在较弱的非共价相互作用, 随着复合物透过细胞进入血液循环, 药物与促进剂解离释放出药物(图 26)^[58]。

2017年, 诺和诺德便宣布FDA批准了索马鲁肽改善II型糖尿病患者的血糖控制。虽然索马鲁肽是长效的GLP-1激动剂, 但糖尿病患者仍需每周注射一次。为了提高患者的依从性, 诺和诺德很早就开始了口服索马鲁肽的研究。研究人员将索马鲁肽与吸收促进剂SNAC制成口服配方。SNAC与索马鲁肽结合使得其在胃部吸收, 而且溶解的SNAC在胃部形成局部相对较高的pH环境, 既可以增加索马鲁肽的溶解度, 在该环境下索马鲁肽受胃肽酶的影响很小, 又促进了索马鲁肽的吸收^[59]。从图 27中可以看出, 口服索马鲁肽在胃部可以充分吸收并快速释放。2019年9月20日, 口服索马鲁肽被FDA批准用于结合饮食和运动以改善II型糖尿病患者的血糖控制。

4 增强肽类分子的水溶性

含有疏水侧链的多肽往往水溶性较差, 而含有极性侧链的多肽水溶性相对较好。不同的多肽因其组成不同而具有不同的溶解性。有些临床使用的多肽药物常常含有芳香性氨基酸如苯丙氨酸、酪氨酸等, 但是这类含有芳香性氨基酸的多肽常常溶解性很差。胰高血糖素含有半数以上疏水性侧链, 且含有多个芳香性氨基酸, 因此, 其在水溶液中溶解性差。

临床上通常使用胰高血糖素治疗急性低血糖。临床使用的胰高血糖素通常以冻干粉末的形式保存, 使用时需要用无菌酸性溶剂溶解, 但溶解时常常产生不溶性纤维^[60, 61]。因此, 通过合适的修饰改造策略提高胰高血糖素的溶解性对胰高血糖素的临床使用有重要意义。天然的胰高血糖素85在PBS中的溶解度很小, Morz等^[62]将胰高血糖素中的苯丙氨酸或酪氨酸替换为吡啶基丙氨酸3-pal或4-pal, 尤其是多个位点替换(表 5), 得到的肽在PBS溶液中的溶解性有了一定程度提高, 其中肽87和88, 在保持胰高血糖素活性的同时, 溶解度提高, 大于15 mg·mL^-1。这也表明引入吡啶基团可以提高多肽分子的水溶性。Mayer等^[63]也报道了利用吡啶基替换苯丙氨酸或酪氨酸中的苯环以提高多肽类降钙素基因相关肽受体拮抗剂的水溶性。

5 总结与展望

随着全球小分子药物研发的难度增加以及生物大分子药物研发速度的不断加快, 介于两者之间的多肽类药物也成为全球制药公司关注的焦点, 多肽药物的销售额也在逐年稳步上升。目前全球批准上市的多肽药物已超过80多种, 进入临床的多肽分子数量也在不断增加, 疾病领域涉及肿瘤、代谢性疾病、感染性疾病、免疫、心血管疾病以及泌尿生殖系统疾病等, 其中还有诸如甘精胰岛素和利拉鲁肽这种重磅炸弹级的多肽药物, 因此多肽药物的前景非常广阔。

多肽药物均衡了小分子药物和生物药的优点, 具有活性强、选择性好、安全性高, 不容易在体内蓄积、与其他药物相互作用少、代谢途径可预测等优点, 是一类理想的可用于开发成为药物的先导化合物。然而多肽药物本身也存在着半衰期短、血浆清除率高、不容易透过细胞膜、大多数药物不能口服, 通常需要注射给药, 患者依从性差以及生产成本较高等问题, 这些问题制约了多肽类药物的发展。采用多种化学修饰策略如末端结构修饰、拼接策略、环化策略、非天然氨基酸修饰、伪肽策略以及胆固醇修饰等可以提高肽类分子的活性; 除了上述部分方法可以提高肽的稳定性, 还可采用逆肽策略以及高级脂肪酸修饰、蛋白融合策略、聚乙二醇修饰等策略提高肽类分子的代谢稳定性; 采用引入卤素原子、去除极性侧链、手性策略、N-烷基化、高级脂肪酸修饰等策略可以改善肽类分子的渗透性。许多成功上市的多肽药物都用到了这些改造策略中的一种或几种。

目前, 通过对肽类分子的修饰和改造解决多肽药物的缺点, 仍然是最直接和有效的策略。熟悉了解多肽药物的基本改造策略, 对于多肽类药物的研究和开发具有重要意义。虽然多肽药物的发展仍然面临着一些挑战, 但随着未来药物化学改造策略的完善以及新型药物递送系统以及吸收促进剂的不断发展, 这些技术都将会应用到多肽药物的开发之中, 为多肽药物的开发提供更合理更丰富的思路。

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