借助中医药发展的东风，目前药食同源的研究热度也持续上升，越来越多的研究开始探讨植物中的活性成分及其对健康的潜在益处，不仅是咱们国人在研究，国外团队也研究的越来越多。
今天生信路带来这篇是来自重庆医科大学郭风劲教授团队近期发表在NC上的文章。研究发现了一种来自蜂王浆的天然药食同源小分子化合物10-HAD，能够通过靶向天冬酰胺β-羟化酶来抑制软骨细胞衰老，从而在小鼠中预防骨关节炎。机制研究揭示了10-HDA通过ERK/p53/p21和GSK3β/p16信号通路减轻细胞衰老。研究设计逻辑链条完整，非常值得学习和借鉴。如果想通过中医药方向或者其他方向做方案设计和数据分析的宝子直接滴滴生信路就可以了。
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题目：10-羟基-2-十烯酸通过靶向天冬氨酸β羟化酶和抑制雄性小鼠软骨细胞衰老来预防骨关节炎
研究背景
骨关节炎是一种退行性关节疾病，以关节疼痛为主要症状，由关节软骨纤维化和丧失引起。由于骨关节炎的复杂性和异质性，临床实践中缺乏有效的个体化治疗骨关节炎的药物。据报道，软骨细胞衰老参与骨关节炎的发生和发展。
10-羟基-2-十烯酸（10-HDA）是一种源自蜂王浆（RJ）的天然药物和食品同源化合物。据报道，10-HDA可以通过抑制UVA诱导的细胞衰老和活性氧（ROS）的产生来预防和治疗皮肤光老化。本研究旨在探讨10-HDA是否以及如何缓解软骨细胞衰老，防止关节软骨退化。本研究拓宽了OA食品中天然药物的治疗前景。
研究结果
10-HDA促进增殖和合成代谢，同时抑制软骨细胞凋亡和分解代谢
为了研究10-HDA对软骨细胞增殖和代谢的影响，使用了野生型C57BL/6 J小鼠软骨提取的原代软骨细胞和人C28/I2软骨细胞。
接下来，评估了10-HDA促进细胞增殖和合成代谢的能力，同时在IL-1β (10 ng/mL)存在下抑制细胞凋亡和分解代谢的能力。结果发现，IL-1β存在下的10-HDA（2、5和10 nM）增加了细胞活力，细胞增殖基因CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、cyclinA1、cyclinB1、cyclinD1、cyclinE1和PCNA的表达、增殖率以及合成代谢标志物SOX9、COL2和ACAN的增殖率，而与IL-1β处理对照组相比，小鼠原代软骨细胞或C28/I2细胞的凋亡率、分解代谢基因MMP13和IL6的表达均受到抑制。
10-HDA增强人软骨外植体软骨细胞合成代谢，抑制软骨细胞分解代谢
为了进一步探讨10-HDA对OA患者膝关节软骨组织的影响，在体外用IL-1β (10 ng/mL)刺激10-HDA治疗OA患者膝关节软骨组织。首先，检测到在IL-1β处理的对照组中，所有细胞增殖标记基因CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、cyclinA1、cyclinB1、cyclinD1、cyclinE1和PCNA的mRNA水平均下调。相反，观察到10-HDA处理后上述增殖标志物的表达上调。然后探讨了10-HDA对人软骨外植体合成代谢和分解代谢的影响。结果发现，IL-1β显著降低了SOX9、COL2和ACAN的mRNA水平，增加了MMP13的表达，而与IL-1β处理的对照组相比，5 nM和10 nM的10-HDA处理的软骨外植体显示出SOX9、COL2和ACAN的转录水平增加，而MMP13的表达减少。此外，western blot和免疫荧光（IF）分析进一步证实。OA的病理特征还在于软骨细胞外基质的降解。因此，作者研究了上述处理的人软骨外植体中软骨基质的损失。甲苯胺蓝和红花素O/快绿染色表明，IL-1β引起软骨降解，而10-HDA处理部分恢复了这种表型。
关节内注射10-HDA可减轻手术诱导DMM模型的骨关节炎和疼痛
为了进一步了解10-HDA在体内对OA的影响，使用了实验性的内侧半月板不稳定（DMM）小鼠模型。收集DMM手术后8周小鼠的膝关节。DMM手术后膝关节和软骨组织的一般观察显示关节肿胀和软骨缺损。然而，作者发现关节内（IA）注射10-HDA可有效预防上述关节损伤。
膝关节切片苏木精和伊红（HE）染色显示，与假手术组相比，DMM手术组软骨细胞数量减少；然而，10-HDA处理提高了细胞密度。膝关节软骨侵蚀和软骨浅表区丧失是OA13的突出病理特征。用粘多糖标记物safranin O对膝关节切片进行染色表明，10-HDA治疗可显著改善这些病理改变。使用国际骨关节炎研究学会（OARSI）评分半定量系统进行的分析显示，与载药组相比，10-HDA治疗组的评分降低。此外，观察到10-HDA也促进了软骨厚度，揭示了其在DMM手术小鼠中抑制软骨降解的作用。免疫荧光染色进一步显示DMM术后软骨组织中合成代谢标志物Col2和Acan蛋白水平降低；然而，在给药10-HDA后，这种效果被逆转。此外，与对照组相比，10-HDA治疗降低了分解代谢标志物Mmp13的蛋白水平。与组织病理学结果一致，8周后，给药10-HDA增加了整个关节Col2和Acan的mRNA水平，而降低了Mmp13的转录水平。
von Frey试验被广泛用于检测OA模型的疼痛敏感性。使用步态分析检查了DMM手术后小鼠的疼痛相关行为。观察到，注射10-HDA后，与载药组相比，打印面积和最大接触面积均有所增加，表明10-HDA减轻了DMM手术引起的疼痛相关行为。综上所述，实验结果表明，IA注射10-HDA在体内促进软骨合成代谢，抑制软骨降解，缓解OA患者膝关节疼痛。
口服10-HDA在DMM模型中对OA有保护作用
进一步验证了口服10-HDA对OA小鼠的影响。小鼠膝关节切片HE染色显示，与载药组相比，口服10-HDA后小鼠软骨细胞数量增加。同样，红花素O/快绿染色显示载药组软骨明显磨损，表面或全层缺失，导致软骨厚度下降，OARSI评分升高。然而，观察到口服10-HDA部分缓解了DMM诱导的软骨退变，并在治疗7周后改善了OARSI评分。此外，IF染色显示，与载体组相比，10-HDA增加了软骨中Col2和Acan的蛋白水平，而降低了Mmp13的蛋白水平。von Frey试验显示，口服10-HDA增加了足跖脱断阈值，减轻了OA相关疼痛。此外，与载药组相比，口服10-HDA在8周时减少了站立和单站立，这表明10-HDA减轻了DMM手术后增加的疼痛相关行为。
ASPH是10-HDA的独特靶点
为了探索10-HDA在介导软骨细胞稳态过程中可能的结合靶点，作者进行了药物亲和反应靶稳定性（DARTS）试验。鉴定出天冬氨酸β-羟化酶（ASPH）是10-HDA的潜在候选结合靶点。为了进一步确认ASPH是否是10-HDA的结合靶点，使用一系列含10-HDA或不含10-HDA的嗜热细菌蛋白酶处理的DARTS样品进行了western blot。发现10-HDA保护ASPH蛋白免受蛋白酶消化。此外，进行了细胞热移实验（CETSA）。观察到，当温度在40至64°C之间时， 10-HDA处理组的ASPH蛋白水平高于DMSO对照组。
10-HDA通过ASPH的Asp-Arg-Hydrox结构域调节软骨细胞代谢
为了研究ASPH对OA的影响，作者测量了OA患者、人软骨移植体和DMM手术后小鼠的未受损和受损软骨中ASPH的表达。发现与人OA软骨未损伤组相比，损伤组中ASPH mRNA和ASPH蛋白水平均下调。与上述结果一致，IL-1β处理的人软骨外植体和DMM小鼠膝关节中ASPH蛋白水平均降低。有趣的是，与载药组相比，10-HDA显著抑制了OA诱导的ASPH表达下调。
为了探究10-HDA是否通过ASPH调节软骨细胞代谢，作者在HEK-293T细胞中通过siRNA敲低ASPH的表达。观察到，敲除ASPH削弱了活化的COL2荧光素酶报告基因，而促进了10-HDA诱导的MMP13报告基因的抑制。此外，使用CRISPR-Cas9基因组编辑方法敲除C28/I2细胞中的ASPH基因。在IL-β刺激下，发现在APH-敲除（KO）细胞中，10-HDA诱导的软骨合成代谢激活被抑制。此外，10-HDA介导的软骨分解代谢抑制在ASPH-KO细胞中几乎完全被消除，导致分解代谢标记基因MMP13的表达增加。随后，在ASPH- ko C28/I2细胞中重新表达了含有10-HDA结合域的ASPH Δ2突变体。在IL-β刺激下，用Δ2-过表达 pcDNA3.1质粒转染这些细胞，在很大程度上恢复了10-HDA诱导的软骨合成代谢的激活和软骨分解代谢的抑制。Western blot分析COL2和MMP13蛋白水平与qPCR结果一致。这些研究结果表明，10-HDA通过ASPH的Asp-Arg-Hydrox结构域调节软骨细胞代谢。
10-HDA通过体外和体内抑制软骨细胞衰老来缓解OA
由于GSEA显示部分DEGs在细胞衰老中富集，作者进一步验证了10-HDA在体外和体内缓解软骨细胞衰老的作用。首先观察到，在10-HDA处理的C28/I2细胞中，衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色降低。同时，与IL-1β对照组相比，在IL-1β存在的情况下，经过一系列10-HDA处理的人软骨外植体、人C28/I2软骨细胞和小鼠原代软骨细胞中，细胞衰老标记基因p16和p21的mRNA水平降低。进一步说明了10-HDA的抗衰老作用。免疫荧光染色显示，通过IA注射10-HDA处理DMM小鼠的膝关节中p16和p21蛋白水平降低。
接下来，作者探讨了10-HDA对自然衰老小鼠软骨细胞衰老和软骨变性的影响。膝关节直径测量显示，与幼龄小鼠组（对照组）相比，老龄小鼠组（载药组）的横径和正径更大，注射IA或口服10-HDA均能有效减小膝关节直径，从而防止关节肿胀。红花素O、甲苯胺蓝染色和OARSI评分显示，与载药组相比，10-HDA部分缓解了衰老诱导的软骨变性，提高了OARSI评分。膝关节免疫组化（IHC）染色进一步显示衰老小鼠（载药组）p16、p21、Mmp13蛋白水平升高，Col2降低；在给药10-HDA后，这种效果部分逆转。免疫荧光染色也显示衰老小鼠Asph蛋白水平降低，而IA注射10-HDA使Asph表达增加。
10-HDA介导的软骨细胞衰老抑制需要ASPH
最后，作者研究了依赖于ASPH的10-HDA调节软骨细胞衰老的潜在机制。根据文献和RNA-Seq结果，检测了10-HDA靶向ASPH是否以及如何通过MAPK和p53信号通路调控软骨细胞衰老。发现，10-HDA诱导的细胞外信号调节激酶（ERK）磷酸化水平的升高和p53磷酸化水平的降低在APH- ko细胞中被消除，从而导致衰老标志基因p21的表达在10-HDA处理后没有改变。然而，用Δ2-过表达质粒转染APH- ko C28/I2细胞，恢复了10-HDA促进ERK （p-ERK）磷酸化和抑制p53和p21磷酸化的作用。
先前的研究表明，ASPH通过抑制肝细胞癌中糖原合成酶激酶3β (GSK3β)的磷酸化和p16的表达来抑制衰老。因此，作者研究了ASPH/GSK3β/p16轴在10-HDA处理的软骨细胞中的作用。我们检测到C28/I2细胞中磷酸化的GSK3β (p-GSK3β)和p16的水平随着10-HDA浓度的增加而降低。同时，们观察到，LY294002（一种GSK3β磷酸化抑制剂）降低了ASPH-KO细胞中GSK3β和p16蛋白磷酸化水平的增加）。10-HDA对GSK3β磷酸化的抑制作用在APH- ko细胞中减弱，导致p16表达不变。然而，ASPH Δ2突变体的表达恢复了对GSK3β磷酸化和p16表达的抑制作用。总的来说，这些结果表明10-HDA通过ASPH/ERK/p53/p21和ASPH/GSK3β/p16轴抑制软骨细胞衰老。
文章小结
综上所述，该研究结合了分子生物学、细胞生物学、动物模型和药理学等多种方法，提出药食同源化合物10-HDA可通过抑制软骨细胞衰老有效治疗OA，并鉴定出ASPH为10-HDA的新靶点。此外，10-HDA可以通过ERK/p53/p21和GSK3β/p16途径调节OA。
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