类器官（Organoids）是一种体外培养的三维细胞结构，它们能够模拟真实器官的组织结构和功能特征。类器官的概念最早可以追溯到1902年，由德国科学家Hans Driesch提出，他通过实验展示了细胞的多能性。然而，直到21世纪初，随着干细胞技术和组织工程学的发展，类器官的研究才真正开始兴起。通常类器官来源于组织特异性成体干细胞（ASCs），多能干细胞（PSCs；胚胎干细胞/诱导多能干细胞），和患者组织来源类器官（PDOs）等。以上来源的类器官各自有其特征，可基于研究目的选择合适的来源的类器官开展后期的研究。
类器官作为体外新兴人源化模型，因其具有和人体真实器官类似的细胞组成、结构、形态和功能，并能够进行长期、稳定的传代培养的特点。在2013年被 Science 期刊评为年度十大技术，在2017年被 Nature methods 评为年度方法，已经成为当下生命科学领域炙手可热的研究手段。目前，类器官技术被认为是最有潜力的可代替动物试验的方案。
单细胞测序技术也是近年来一直备受青睐的明星技术，分别在2018年和2019年被 Science 期刊评为年度十大技术，并同步被 Nature methods 评为年度方法。通过将类器官与单细胞测序相结合，利用单细胞测序技术从细胞图谱、基因表达等层面分析类器官和真实器官的相似程度，以及类器官相关疾病模型之间的差异，可以检测类器官中动态转录变化，解析机体的发育分化过程以及类器官细胞与周围基质之间的互作和信号通讯等。所以，单细胞测序和类器官这两项技术的联合会成为研究热门势不可挡，是将前沿医学研究领域和科学研究探索推入一个新高度的重要手段，必将成为2025年国自然新热点。
那么，类器官技术与单细胞测序预计会在2025年国自然申请过程中碰撞出怎样的科研新热点？而类器官在单细胞实验过程中会遇到哪些问题？二者结合又是如何推动科研进步？又有哪些新的研究领域待开发？且听下文娓娓道来~
用“类器官”和“单细胞测序”两个关键词在PubMed上检索标题带有该关键词的文章，从1976年至今共计855篇。其中2023年一年就有192篇文章发表，2024年已有172篇文章发布，可见类器官+单细胞研究的巨大潜力。
为什么类器官+单细胞测序会成为2025年国自然申报新热点？
随着相关科学研究的不断发展，类器官因为其与体内组织器官相似的生理结构，没有严格的病理申报，且能够更为准确模拟常规组织样本之间细胞的异质性以及细胞间及细胞与周围基质之间的相互作用。因此目前类器官在器官发育、疾病建模、再生医学、药物筛选、基因编辑等领域具有十分广泛的应用价值。
目前，已调研的结果中发现，类器官已用于包括脑、肠道、肝脏、胰腺、肾脏、前列腺、肺、乳腺等多种组织。通过将单细胞与类器官两者强强联合将会成为2025年医学和生物学的研究新的热点。
4.1类器官送样标准及细胞数量？
（1）解离样本保存方法：
1.保持原本培养环境（直接带培养基）低温运输即可；
2.将类器官直接加到组织保存液里，4-8℃运输即可。
（2）抽核样本冻存方法：
1.对培养板每个孔中的类器官进行计数，一般一支2mL的冻存管冻存200-300个类器官；
2.去除孔中培养基，加入1mL预冷的含0.1%BSA 的PBS，轻柔吹打3-5次，将Matrigel从板底吹起并打碎，将悬液移入15mL离心管中；
3.将类器官在4℃，300-500g离心5分钟，去除上清，加预冷的PBS重悬，重复清洗过程3-5次直至胶去除干净；最后一次离心后，将上清去除干净；
4.依据200-300个类器官/500μL冻存液（推荐使用Corning Cat.No.88-702-CB）比例加入相应体积的冻存液；
5.轻柔重悬类器官后取500μL转移入耐-192℃低温的螺纹口冻存管后，标记好直接移入-80℃冰箱，无需冻存盒梯度降温；经此方法冻存的类器官可在-80℃短期保存1个月，长期保存可转入液氮罐中，干冰运输。
4.2类器官样本的单细胞检测需不需要重复？
同组的类器官样本因为其遗传背景和培养条件都是保持一致的，但是对于单细胞这种高分辨率的测序技术而言，我们建议最少能提供3个重复样本，以方便后续数据展示的可靠性。
4.3如何鉴定类器官中的细胞类型？
常见的细胞鉴定有三种
其一：利用一些常见的自动化细胞鉴定的软件进行细胞鉴定，例如single R等；
其二：利用文献中的常见marker进行细胞鉴定；
其三：当single 且文章中并没有合适的marker基因时，也可以采用高表达基因从功能层面上鉴定细胞。
（1）对比类器官与来源组织的一致性
与传统的二维培养相比，三维培养的主要优势在于三维结构决定了更全面、更接近生理的特化细胞类型。例如，2021年发表在Cancer Discov的文章“Single-cell atlas of lineage states, tumor microenvironment and subtype-specific
expression programs in gastric cancer.”，通过单细胞分辨率分析了在患者来源的类器官（PDOs）和原发肿瘤之间的单细胞比较突出了细胞系间和细胞系内的相似性和差异性，并将PDOs的分子边界作为实验模型进行了界定。研究结果为不同胃癌亚型患者内和患者间谱系状态提供了高分辨率分子资源。
（2）单细胞测序+类器官研究组织发育
类器官是由干细胞发育而来，能够模拟真实组织器官发育演化进程，通过对不同发育时期的类器官样本进行单细胞测序，可以探索组织器官发育过程中关键性的调控因子。通过单细胞测序技术深入解析组织器官发育过程中细胞类型的变化，以及对应的差异表达基因的改变，以及对关键细胞进行拟时序分析来锁定组织器官发育中的关键调控因子/关键性的基因，模拟组织器官发育过程中细胞的分化发育轨迹；当然也可以 从单细胞多组学的角度出发，通过单细胞转录组测序+单细胞ATAC seq分析深入探究组织器官发育早期染色质的开放特性，锁定在组织器官发育早期的关键性的转录调控因子，将细胞发育和表观遗传相关联。此外单细胞加空间转录组的联合分析，可以通过单细胞转录组技术锁定关键性的细胞群，再利用空间转录组看关键细胞群的空间定位信息，在器官发育过程中往往细胞的空间定位信息十分重要。
（3）单细胞测序+类器官研究肿瘤异质性
肿瘤免疫微环境是指肿瘤细胞周围的复杂网络，包括免疫细胞、炎症细胞、血管、细胞外基质等，影响着肿瘤的发展和治疗反应。且在肿瘤生长过程中，肿瘤细胞发生多种变化，也会进一步介导肿瘤侵袭以及对药物的敏感性，进而导致患者的预后效果较差。近年来，单细胞测序在探究肿瘤组织免疫微环境的文章很多，通过将单细胞结合肿瘤组织类器官的研究除了能够探究所对应肿瘤组织中的细胞类型之外，还可以研究肿瘤内不同类型细胞间的互作，从而深入探究肿瘤发生发展的机制，进行更精细的疾病肿瘤亚型的分析，为肿瘤精准化治疗提供更多的理论依据。
（4）单细胞测序+类器官进行药物筛选和耐药机制研究
类器官是人源化模型，因其特征及来源，故而类器官更能反应人体对药物的反应程度，也更能准确反应药物的耐药机制，可以为临床用药提供更精准的临床指导。通过借助单细胞测序技术深入探究药物干预/其他治疗干预条件下，不同细胞类型的差异，对比筛选出药物敏感性的治疗靶点，进而筛选出针对不同疾病分型下最有效的药物，此外利用单细胞+类器官结合的方案还可以对类器官中细胞耐药和药物作用机制进行更为深入的研究。
近年来，类器官技术及单细胞测序技术的飞速发展，进一步加速了肿瘤学、发育生物学以及相关的药物筛选和研发等多个领域的发展。因此，单细胞测序应用于类器官技术上，能极大程度地推动生物医学领域的发展，更加高效的为人类医疗服务。
案例一：大规模人脑皮层类器官单细胞测序揭示大脑发育动态特征
英文名称：Proper acquisition of cell class identify in organoids allows definition of fate specification programs of the human cerebral cortex
期刊：2022年
研究内容：2022年，美国哈佛大学及Broad研究所Paola Arlotta教授领导的团队在Cell杂志在线发表了题为Proper acquisition of cell class identify in organoids allows definition of fate specification programs of the human cerebral cortex的研究论文，通过对23天至6个月共八个不同发育阶段的大脑皮层类器官进行单细胞测序，提示了皮层类器官发育过程中的细胞类型多样性与内源性胚胎发育近似，且不受代谢状态的影响，这一结果再次证实了大脑类器官作为体外发育模型在研究人脑皮层发育中的重要研究价值。
研究人员比较了人脑类器官和内源性人类胚胎组织发育的相似性。通过对不同阶段皮层细胞类型特征的捕捉，研究人员观察到，人脑类器官发育过程中的差异表达基因特征反映的是已知的内源性胚胎发育过程中发育阶段/细胞类型特异性的标志基因。经过一系列细胞类型调控机制的研究，研究人员详细比较了人脑类器官和胚胎皮层细胞类型的重叠度并证实，人脑类器官的细胞类型能很好地代表内源性胚胎皮层的转录及表观状态特征。
类器官研究领域内有多项研究均表明，代谢途径能引起类器官细胞类型产生特异突变。对不同时间点的人脑类器官进行WGCNA分析后发现，糖酵解相关基因开始在体外发育的1.5个月的时间点开始富集。研究人员比较了不同培养条件下的代谢差异，发现糖酵解途径和缺氧途径相关基因均在aRG和未定PN细胞类群中富集，提示这些神经前体细胞可能对能量代谢表现出特定需求。为研究人脑类器官皮层的代谢状态和空间位置的关联，研究人员使用空间转录组技术研究代谢途径基因的空间表达，发现大量皮层细胞类型的分化并不受代谢状态的影响。
案例二：单细胞转录组系统评价结直肠癌类器官系统
英文名称：Systematic evaluation of colorectal cancer organoid system by single-cell RNA-Seq analysis.
期刊：2022年
研究内容：作者建立了结直肠癌患者源性器官，对七名患者的器官培养物、对应的肿瘤组织和正常组织进行单细胞RNA-Seq分析，从肿瘤组织获得的器官培养物在基因表达水平上忠实地重现了癌细胞的主要基因表达特征。另一方面，从正常组织获得的器官培养物在整个转录组水平上表现出一些肿瘤样特征，但保留了正常的基因组特征，例如拷贝数变异、点突变和正常的全局DNA甲基化水平，对于两种培养基都如此。在长期培养肿瘤上皮细胞方面，条件培养基优于化学定义培养基。交换培养基后，器官培养物中的细胞基本上保持了原始培养基的转录组特征。
案例三：原发性肿瘤和胰胆癌配对类器官的单细胞转录组分析
英文名称：Single-cell transcriptome profiling of primary tumors and paired organoids of pancreatobiliary cancer
期刊：2023年
研究内容：2023年12月，北京大学科研团队为了揭示原发肿瘤及其匹配的类器官在转录组水平上的相似性和差异，对来自一名胆管癌（CCA）和两名胰腺导管腺癌（PDAC）患者的配对原发肿瘤和类器官进行了scRNA-seq，确定了患者间和肿瘤内的异质性，并发现类器官保留了原发肿瘤的拷贝数变异（CNV）模式。所有类器官在转录水平上均表现出从经典亚型向基底样亚型的过渡趋势。类器官和原发性肿瘤在代谢和未折叠蛋白反应（UPR）特征上存在差异。此外，该研究还揭示了癌症相关成纤维细胞（CAF）和T细胞的异质性，并探索了T细胞的发育轨迹。这些研究结果有助于进一步了解类器官模型，并证实其在胰胆癌中的应用前景。
案例四：女性乳腺纤维腺瘤单细胞图谱揭示不同的上皮细胞组成和治疗靶点
英文名称：Single cell profiling of female breast fibroadenoma reveals distinct epithelial cell compositions and therapeutic targets
期刊：2023年
研究内容：作者绘制了一个人乳腺脂肪酸和正常组织的单细胞转录组，以揭示上皮细胞的组成和结构特征的脂肪酸不同于正常乳腺。scRNA测序分析显示，纤维腺瘤中存在9种细胞类型，包括成熟腔细胞、腔祖细胞、基底细胞、成纤维细胞、内皮细胞、周细胞、T细胞、B细胞和髓样细胞。证明了成纤维细胞富集在FA的基质细胞中，并且进一步地分析证实成纤维细胞的增加似乎不是由更高的增殖诱导的。该结果与先前的研究一致，该研究显示纤维腺瘤中基质细胞中KI67表达较低。
上皮细胞和成纤维细胞共培养系统，并证明成纤维细胞可以招募的上皮细胞的脂肪酸。这些数据突出了上皮在纤维腺瘤形成中的重要作用。研究证实了乳腺FA中管腔细胞（CK8+）数量的增加和基底细胞（CK14+）的减少，这意外地导致了正常双细胞结构特征的丧失。此外，结构和细胞组成的变化，在上皮细胞中的脂肪酸导致雌激素反应的功能签名。作者的数据提供了对FAs中上皮细胞通路的关键见解。本文证实，除了激素敏感途径外，内分泌抵抗途径在人脂肪酸中也被激活。
目前类器官仍然处于疾病相关研究模型的发展早期阶段，但由于其能够高度逼真地再现真实病理组织的结构特征，所以在阐述高度复杂的临床生物学问题方面非常有益，而这也有助于我们获得更加真实的临床研究结论。目前类器官在前期干预性实验与实时监测实验中的应用非常广泛，而这是很多临床样本往往难以实现的；
毫无疑问，类器官下一个里程碑将是结合多组学技术应用于临床转化研究领域中，尤其是以单细胞测序为代表新兴组学技术，以期获得更全面、更真实的组学图谱。我们相信通过将类器官与单细胞测序结合，也将使得我们对生物学机制的探索迈入新时代。
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