一文讲透去宿主DNA的各种实验方法 | 微生物专题

宏基因组测序技术（Metagenomic Sequencing）是一种直接从环境样本中提取总DNA，通过高通量测序分析微生物群体基因组的方法。它包括了可培养和未可培养的微生物遗传信息，从而增加了获得新生物活性物质的机会。目前宏基因组测序技术被广泛应用于各种环境微生物生态的研究、各种感染性疾病的诊断、新发及突发传染病病因分析等等，在农业，医疗，工业生产等等领域有广泛的运用前景。

虽然宏基因组技术有无需培养，检测范围广泛等优点，但是，由于样本中宿主基因组一般来说远大于样本中的微生物基因组，比如，人的基因组大小（3.2Gb）就比细菌基因组的平均大小（3.6Mb）大1000倍左右[1]，因此，只要样本中有少量宿主细胞存在就可以完全淹没微生物的DNA成分。例如，当脑脊液中的人类细胞计数超过每立方毫升200个细胞时，这种高宿主DNA背景可能会压倒病原体信号，并降低宏基因组NGS检测[2]的敏感性。而同时样本中宿主细胞数通常也远高于微生物细胞，因此采用普通的DNA提取方法，得到的DNA中宿主DNA占绝对多数。而宏基因组测序的建库环节无法对样本核酸进行选择性建库，因此在宏基因组测序中无选择的使用原始的样本进行核酸提取和建库可能会造成：

（1）提取时与目标病原体核酸竞争核酸捕获材料，造成病原体核酸提取效率降低。

（2）文库构建时竞争接头，连接酶等造成目标DNA文库构建效率降低。

（3）在测序环节，挤占大量测序数据，在测序深度不够时，可能造成假阴性结果

1.1样本中的宿主比例

不同样本中宿主含量差异很大，以人源性样本为例，对来自人体的各种不同样本进行测序，再对数据中人来源的reads计算发现：

（1）粪便样本中一般人的数据＜10%，

（2）人类唾液、鼻腔和阴道样本＞90%，

（3）皮肤样本介于40%~80%，

（4）舌头样本大多在10%-20%，

（5）牙龈样本20%-50%。

图1：不同类型的人来源的样本中宿主的含量（该研究中使用的样本数：粪便= 249，皮肤= 29，阴道= 103，鼻腔= 112，内脸颊= 175，舌头= 208，牙龈= 189，唾液=24^[3]

因此，对于宏基因组测序来说，很多类型的样本原则上是需要进行宿主去除后再进行实验的，在科研过程中研究者尝试许多不同的去宿主方法，效果参差不齐。

2.1纯物理方法

哺乳动物细胞和微生物细胞之间最明显的区别之一是它们的大小。例如口腔上皮细胞平均有50μm宽，而典型的细菌球菌直径是1μm左右，因此，理论上可以利用这种特性，采用纯物理方式对宿主细胞和微生物细胞进行分离。

研究者通过以下方式对唾液样本进行了宿主分离，并设计了qPCR实验检测结果

用5μm滤膜过滤唾液样本，而后对滤液，滤渣，原始样本进行DNA提取后再以qPCR检测宿主含量（图2 A），结果未见明显效果，三者宿主含量没有明显差异。

以不同离心速度收集不同大小细胞,首先，对人唾液进行短、缓慢的离心（2500g），使大细胞沉淀，然后取上清用更长、更快的离心（10000g），得到剩余细胞，再以qPCR检测：原始样本、低速离心上清、低速离心沉淀、高速离心上清、高速离心沉淀中宿主含量（图2 B）。结果未见明显效果，高速低速产生的沉淀和上清宿主含量与原始样本无明显区别。

以流式细胞仪分离样本中的不同大小细胞(图2 C)，再对原始样本和大中小四组样本进行测序，检测各个组中的人基因组reads（图2 D）未见明显效果,不同大小的部分宿主含量基本无差异。

图2：物理方法去除人唾液样本中宿主的效果

可见纯物理方法效果都不好，有研究发现差速离心和流式或微流控筛选后加DNA酶消化有一定效果^[4]，推测与DNA酶消化了游离的宿主核酸有关。

2.2生化方法

宏基因组测序主要是针对样本中细菌，真菌等微生物，这些类型的微生物细胞与动物细胞的区别，除了大小之外，就是动物细胞没有细胞壁结构，因此可以使用皂苷、Triton X-100，Tween 20等“温和”裂解试剂，通过某些样本的宿主细胞没有细胞壁的特点，裂解宿主细胞的同时尽量保持细菌细胞完整，再以DNA酶处理宿主细胞裂解后游离出的宿主DNA，去除样本中的宿主DNA以后，再对微生物样本进行裂解和DNA提取。这是目前市场上大部分去宿主试剂盒去除宿主的主流方法^[5]。

杂交捕获是指使用与目标DNA反向互补的探针，探针以生物素或其他方式标记，在样本中以杂交的方式结合目标DNA，再以链霉亲和素标记的磁珠将已经结合了目标DNA的探针从样本中分离出来，通过这种方式抓取或者去除目标DNA。

以类似捕获测序的方式，捕获富集样本中的病原体核酸序列或者以宿主探针反向捕获去除宿主^[6]，但是这种方式实用性不强。首先，成本过高，探针的设计合成标记菌需要较高的成本，且实验过程复杂，实验周期长，人力和时间成本也较高。其次，作用有限，正向捕获微生物的方式，无法捕获样本中的未知微生物，使宏基因组测序丧失了发现样本中未知微生物的重要功能，而反向捕获效率有限，对宿主去除效果也不好。

原核生物和真核生物都存在基因组DNA的甲基化，这是生物主要的表观遗传，但微生物和人类的表观遗传具有不同的特征和功能。在高等真核生物中，5-甲基胞嘧啶是甲基化DNA的主要形式，比如人类的DNA甲基化大约有60%-90%发生在CpG岛中，通过真核生物和原核生物甲基化方式不同，采用特异性抗体捕获原核DNA，或用特异性抗体去除宿主DNA^[7]，也是一种可用于宿主去除的方法，并有相应的试剂盒，如LOOXSTER^® Enrichment Kit试剂盒采用的是特异性抗体捕获富集原核DNA，而NEB Next Microbiome DNA Enrichment试剂盒则是采用特异性抗体捕获去除宿主DNA。

以这种方式进行宿主去除成本较高，牵涉到抗体，试剂的储存和操作也较复杂，且目前发现某些原核生物，如幽门螺杆菌甲基化模式类似真核生物，可能会造成宿主去除时，某些特定的原核生物也一起被去除。

 比较各种去宿主方法，无论从成本还是效果考虑，差异裂解方法是最经济有效的方法，差异裂解采用的试剂和浓度多种多样，效果也各不相同。

3.1不同浓度皂苷

皂苷是宿主去除中常用的裂解试剂，但是采用何种浓度对样本进行处理，不同的研究表明不同浓度的皂苷处理对不同的样本会产生不同的结果。

很多研究报告，采用低浓度（≤0.1%）皂苷处理体液样本，如：用不同的裂解试剂（saponin, Triton X-100, Tween 20, CHAPS buffer, or MolZym CM buffer）处理混入细菌病毒样本的人鼻咽吸出物和脑脊液，结论为0.025%皂苷效果最好^[5]。

图3：不同处理下（saponin, Triton X-100, Tween 20, CHAPS buffer, or MolZym CM buffer）人鼻咽吸出物，肺炎链球菌，腺病毒，2型孢疹病毒四种样本混合物核酸剩余的百分比情况。

可见0.1%皂苷去除宿主效果最好，但同时也损失了60%以上的肺炎链球菌，20%以上的腺病毒，50%左右的2型孢疹病毒。

图4：使用不同浓度皂苷选择性裂解人细胞的临床标本处理。

脑脊液标本加入肺炎链球菌、2型孢疹病毒、腺病毒、流感嗜血杆菌、大肠杆菌(A图)和鼻咽吸出物标本加入肺炎链球菌、百日咳杆菌、流感嗜血杆菌、腺病毒(B图)，皂苷和Triton X-100最终浓度如图所示。可见采用0.025%处理的样本，宿主去除及保留病原体DNA的情况最好^[5]

另外一个研究案例以掺入百日咳菌的鼻咽吸出物为标本，测试了三种市售的试剂盒：NEBNext Microbiome Kit，MolYsis Basic Kit和Qiagen QIAamp DNA Microbiome Kit，同时测试两种选择性裂解剂，皂苷（终浓度0.025%或 0.012%）和TritonX-100（终浓度0.025%或 0.012%）以及混合裂解试剂，结论为0.025%皂苷去宿主和保存细菌的效果最好^[8]。

也有很多研究采用了高浓度（≥2%）皂苷对样本进行去宿主处理，

如下在血液去宿主的研究案例中，研究人员在每毫升血液样本中掺入10个金黄色葡萄球菌或10个大肠杆菌，以终浓度2%皂苷处理去除宿主后提取的DNA以单细胞扩增试剂盒扩增后建库测序，在测得的reads中：混金葡的样本62.1% reads为金葡，混大肠杆菌的样本73% reads为大肠杆菌^[9]

图5：血液样本采用高浓度皂苷去宿主的实验操作过程^[9]

同时在很多临床研究中，去宿主也采用了相对较高浓度的皂苷，如以下研究案例：

掺入金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的正常人呼吸道样本和临床病人呼吸道样本，终浓度为2.5%皂苷处理，qPCR检测，正常人呼吸道样本去除前后样本中宿主降低1000倍左右，除了肺炎链球菌外其余细菌基本没有变化。

 表1：临床样本测试去除前后宿主DNA最多降低10⁴倍（中位数600倍；四分位数范围168-1156倍；在去除和未去除样本之间观察到最大18054倍）处理前后菌量变化比较剧烈的为肺炎链球菌，流感嗜血杆菌，铜绿假单胞菌^[10]

3.2差异裂解方法的缺陷

相对于其他去宿主方法，差异裂解后再以DNA酶消化暴露的宿主核酸，是目前成本最低，效果最佳的宿主去除方式，但同时也存在一定的缺陷，比如有研究表明，采用皂苷进行宿主去除，高低浓度都可能会造成某些微生物，特别是革兰氏阴性细菌数量的变化^[11]。

但这种菌数量的变化，可能是由于样本中本身存在大量的游离DNA，差异裂解并没有使活菌的情况发生变化，只是DNA酶消化过程中，将样本中大量的游离DNA去除，使微生物图谱发生变化。笔者进行的研究中（数据未发表），不加入皂苷，但采用DNA酶处理的样本，不论是体液样本还是组织样本，提取DNA测序后的微生物优势物种分布情况，与加入皂苷后处理的样本类似，但是与未经过任何处理的样本相比有较大差异，这种结果可能提示，样本中存在大量菌死亡后游离的DNA，DNA酶处理会将这些游离的菌DNA去除。

4.1 Qiagen去除试剂盒

基本原理：差异裂解

适用样本：血液/拭子（拭子以1mL PBS涮洗）^[12]

特色：有针对组织样本的步骤^[13][14]

4.2 MolYsis去除试剂盒

基本原理：混合表面活性剂裂解

适用样本：血液/体液

特色：使用的核酸酶（ endonuclease I from E. coli ）在表面活性剂存在情况下酶活性受到的影响较小

4.3 zymo去除试剂盒

原理：差异裂解

适用样本：体液

特色:组织样本去除需要2mm直径珠打为悬液(需要专门的试剂盒和器械)

4.5 NEB去除试剂盒

原理：利用甲基-CpG结合域（MBD），根据CpG甲基化密度的差异，将甲基化的宿主DNA与微生物宿主DNA分离。

适用样本：纯化后的DNA，长度15 kb或更大，且没有小分子量片段。如果DNA片段大小为< 15 kb，则富集效率较低。

4.6 LOOXSTER去除试剂盒

基本原理：不同物种甲基化CpG二核苷酸发生的频率不同，一种未甲基化CpG绑定蛋白质固定在基质上，DNA绑定到固定蛋白质后，不同浓度梯度洗脱剂洗脱，特定浓度区域的洗脱剂洗下的DNA对应特定CpG甲基化频率，据此分离不同物种DNA。

适用样本：DNA不含蛋白酶和变性或混沌剂（洗涤剂、异硫氰酸胍、盐酸胍等）及螯合剂（EDTA）

参考文献