来源：陈在不在
这三年，一个很好的话题。
有人凤凰涅槃，有人点石成金，但更多是负重前行，不敢轻言放弃。
就笔者兴趣所在，梳理三年在流式界的耳闻目睹。疏漏在所难免，非图看官一笑，读者各取所需。
（本文有4个编号原创表，2个编号原创图，引用需注明出处。）
（在笔者发稿前一刻，纳市上市企业Cytek宣布收购Luminex流式荧光外的仪器业务，对Amnis和Guava这两个命运多舛的品牌来说，可能是一个最好的归宿。）
2021年7月，PerkinElmer公司宣布以52.5亿美元现金和股票组合的方式收购BioLegend，后者在流式试剂领域绝对数一数二，试剂品种过万。
从体量上归纳收购，无非是10+1，或者1+1。后者以1+1>2为结果的概率更高，而被体量数倍甚至数十倍，数百倍的企业收购，要么继续孤芳自赏，要不淹没于茫茫瀚海.....举个例子，1968年第一台商品流式细胞仪的生产公司现在销售额有多大？（纯属个人观念，请勿拍砖。）
HOWARD老爷子书中有“Big Three”的说法，早期是：BD，Coulter，Ortho，后来是BD Biosciences，Beckman Couluter ，DakoCytomation。今天是会有新的三巨头，还是BC，BD，Thermo，PE，Agilent，Cytek并驾齐驱，国内必达科系，迈唯层指等能否脱颖而出，让我们拭目以待。
表1 流式界收购大事记
| 公司 | 收购 |
| BD | 2022-Cytognos：血液流式试剂，EuroFlow联盟许可检测方法 2017-FlowJo：软件 2012-Sirigen：高分子染料，Brilliant Violet系列来自于此 2011-Accuri：小型分析流式 1997-Pharmingen：流式试剂 |
Beckman Coulter | 2019-Cytobank：在线流式数据分析网站 2014-苏州赛景：流式仪器 2013-ReaMetrix：干粉流式试剂 2007-Dako：MoFlo分选、CyAn分析流式 （1995年库尔特公司收购Immunotech， 1998年贝克曼库尔特公司成立） |
Thermo Fisher | 2021-Propel Labs：全光谱流式细胞分选仪 2020-Phitonex：NovaFlour流式荧光染料和700多种流式抗体 2016-Affymetrix（2012年收购eBioscience，eFluor/SuperBright来自后者） 2003-Molecular Probe: Alex Flour/Pacific Blue/SYBR来自于此 |
| PerkinElmer | 2021-Biolegend：过万种流式试剂，Fire，Spark，iFlour等是其品牌 |
| Agilent | 2018-杭州艾森：流式仪器 2012-Dako：临床检验用抗体 |
| Cytek | 2023-DiaSorin：流式细胞仪和成像业务 2021-Tonbo：900余种流式试剂 |
| Abcom | 2021-BioVision：抗体等 2012-Epitomics：兔抗 |
| BioMérieux | 2011-CHEMUNEX：微生物快速检测流式 |
| Bio-Techne | 2022-Namocell：微流控分选 2014-Novus：抗体 1985-R&D：抗体 (由Techne改名而来) |
| DiaSorin | 2021-Luminex：流式荧光，Amnis成像流式，Guava毛细管流式 （2018年Luminex收购Merck的Amnis和Guava，2011年Merck收购Amnis，2009年Merck收购Guava） |
| Medix | 2021-DiaClone：300余种流式相关产品 |
| Sartorius | 2016-IntelliCyt：流式 |
Standard BioTools | 2014-DVS Sciences：质谱流式 (由Fluidigm改名而来) |
| Sony | 2010-iCyt Mission Technology：分选流式 |
| Sysemex | 2013-Partec：流式仪器和试剂 |
临床玩家日益增多
2014年以前，国内临床流式市场完全是国外品牌的天下，并且仅仅是BC & BD。
而在今天已经有19家公司流式细胞仪经NMPA注册批准，其注册机器最高配置、TBNK试剂盒、细胞因子联检等配套情况见下表（绿色表示有）：
表2 NMPA注册流式细胞仪及临床试剂配套*
| （1-4） | Agilent | BC | BD | 必达科** |
| 机器最高配置 | 25C-4L | 13C-3L | 12C-3L | 6C-2L |
| TBNK试剂盒 | 有6色 | 有6色 | 有6色 | |
| HLA-B27 | / | |||
| 荧光单抗 | ||||
| 联检细胞因子 | 备案 | / | / | 有注册 |
| （5-8） | 迈瑞 | 唯公生物 | 层浪生物 | 指真生物 |
| 机器最高配置 | 6C-2L | 6C-2L | 14C-3L | 8C-2L |
| TBNK试剂盒 | / | / | / | |
| HLA-B27 | / | / | / | |
| 荧光单抗 | / | 少 | 少 | |
| 联检细胞因子 | / | 有注册 | / | 备案 |
| （9-12） | 瑞斯凯尔 | 赛雷纳 | 微米生物 | 泛肽生物 |
| 机器最高配置 | 6C-2L | 8C-2L | 6C-2L | 6C-2L |
| 荧光单抗 | 少 | 少 | ||
| 联检细胞因子 | 有注册 | 备案 | 备案 | 备案 |
| （13-16） | 厦泰 | 优利特 | 中科瑞正 | Sysmex |
| 机器最高配置 | 38C-3L | 8C-2L | ||
| 荧光单抗 | 仅CD4 | |||
| （17-19） | 博奥新景 | 中生苏州 | 中研长春 | |
| 机器最高配置 | 6C-2L | 5C-1L |
临床流式更多玩家的加入，首先要得益于国家食品药品监督管理总局通告2017年第226号《食品药品监管总局关于过敏原类、流式细胞仪配套用、免疫组化和原位杂交类体外诊断试剂产品属性及类别调整的通告》，许多抗体归为一类管理。
在NMPA有较多备案抗体的公司，集中如下：
贝克曼库尔特 | 同生时代 | 安捷伦 | |
四正柏 | 杭州联科 | 达科为 | 河南凯普瑞 |
天津美瑞特 | 正熙生物 | 微米生物 | 广州达泰 |
厦泰 | 泛肽生物 | 优利特 | 中科瑞正 |
赛基生物 | 天津三箭 |
从仪器来看，六色荧光成为临床实验室流式基本配置，安捷伦、贝克曼库尔特、BD、层浪生物还升级或新推出了10色以上机器，聚焦全光谱流式的厦泰则有3激光38色的注册机器。
但是，从配套注册及备案试剂来看，10色以上应用还在无票乘车阶段。CD19、CD20、CD22、CD34、CD138等单抗及检测试剂盒等，需要注册，还是只有四家公司。
表3 NMPA流式注册（备案)试剂标记荧光染料
| 激发光 | BD | Beckman Coulter |
| 蓝 | FITC（518nm） | |
| PE（578nm） | ||
| ECD（613nm） | ||
| PerCP（675nm） | PC5（670nm） | |
| PC5.5（695nm） | ||
| PC7（767nm） | ||
| 红 | APC（660nm） | |
| APC-A700（723nm） | ||
APC-Cy7（767nm） APC-H7（765nm） | APC-A750（775nm） | |
| 紫 | BV421（423nm） | |
V450（448nm） | PB（455nm） | |
| V500-C（500nm） | ||
| KRO（530nm） | ||
| BV605（603nm） | ||
这三年，新的应用推出不多，这是临床流式从业者需要关注的核心。
湖南湘奕注册了含线粒体染料Mito，以及初始T细胞表达CD45RA、CD62L的两个试剂盒，值得特别指出。市场推广效果如何不知，但至今资料罕见，也是奇事一件。
人群结核分枝杆菌感染率23%，但只有5%~10%的人会由潜伏性结核感染者转变为活动性结核，结核感染免疫检测有QIAGEN，PE(收购T-spot）以及国内20多个品牌，参与者众。外周血CD161检测据信能辅助诊断活动性结核，深圳联合医学有备案试剂。这是笔者特别感兴趣的方向。
CD64主要表达于巨噬细胞、单核细胞及树突状细胞表面，中性粒细胞和淋巴细胞表面几乎不表达CD64。当机体患感染性疾病时，中性粒细胞表面CD64表达迅速升高，淋巴细胞仍几乎不表达。 一般情况下，机体感染或内毒素入侵时，CD64在刺激后4～6h即可升高。与白细胞计数、C反应蛋白(CRP)和降钙素原(PCT)比较，CD64在诊断感染性疾病中具有更高的敏感性和特异性。当下CD64之推广需要统一指标。
其它关注方向还包括（都是试剂盒，任重道远）：
安捷伦PNH（阵发性睡眠性血红蛋白尿）检测套装，包含CD235a、CD59；
美瑞特骨髓来源抑制细胞MDSCs、功能性NK细胞、颗粒素酶与穿孔素检测；
活化血小板。
临床流式归根结底还是试剂和应用的竞争比拼。自主抗体，荧光标记和专家背书三者缺一不可。免疫力是疾病发作发展的根源，流式大有可为。
多色分析试剂短板
多色分析一直是流式“军备竞赛”的核心内容。不管是传统流式的单激光多色和多激光；还是光谱流式与质谱流式，本质上都是为了增加同时分析的参数数量。
传统流式：目前最高配置是48个荧光检测器。2019年在Front.Immunol.发表了一篇29色文章，紫外光激发7色，紫光激发8色，蓝光激发6色，561nm激光激发5色，红光激发3色。
光谱流式：荧光检测器从55个到184个。目前检索，最多色文章都是采用Cytek机器发表在Cytometry A上的文章，先有一篇Cytek员工自己做的40色，卡塔尔Hamad医疗集团其后发表了一篇43色文章。
质谱流式：理论上都是135个通道，目前实现了47参数方案。
图1是流式多参数分析（不包括散射及其它参数）的仪器现状。不看参数，看表现，对于流式厂家来说，突破29，43，47三个数字，比简单比较更香。
当然，可能首先要回答的一个问题是多参数的意义究竟有多大，一次分析43参数比58参数分两管好在哪里？
多色分析的关键不仅仅在检测器配置，以及数据处理能力。就目前而言，瓶颈还是在配套的荧光染料；对质谱而言，是同位素标记抗体。
我们从Cytek 卡塔尔43色谈开去，以下方案采用18种BD Horizon Brilliant染料，特别为紫外和紫光激发提供了最多选择；方案采用3种Biotium公司的CF染料，该公司提供超过30种CF染料，特别是红光和近红外激发，选择较多。Cytek公司自己的cFlour染料，在蓝光、黄绿光和红光激发上有更多选择。
荧光染料值得再写一文，这里不再赘述。但呼吁厂家不要盲目比较多色，自己先做出来有意义的结果发表再谈。这里的有意义不是纯粹技术上的，而是应用上的。
流式荧光新机出现
流式免疫荧光，又称液相芯片、悬浮阵列。相比化学发光，其最大优势是同时实现多参数检测，这是通过荧光编码微球来实现的。
Luminex流式荧光检测技术的核心为荧光编码微球，技术上采用不同荧光染料的配比。1999年推出，2007年新产品号称可以同时对1个样本中的500种不同目的分子进行检测，并且可以一次检测384个不同样本。上海透景、Bio-Techne、ThermoFisher等68家商业许可签约伙伴（38家诊断，30家科研），在使用Luminex-100/200或xMAP等相关技术平台。
中翰盛泰编码微球采用微米级球表面共价结合纳米级球的方式，微米球和纳米球分别有10种不同荧光染料浓度，微米球还可以加入不同大小。此编码模式获得更大的比表面积，更小的空间位阻。
在笔者看来，流式荧光技术未能取得与化学发光一样普及的根本原因，不在技术垄断，而在：1）应用没有更新，能做的活化学发光都能做；2）化学发光不强调一管多参数，但可以多参数分管检测；3）操作方便性。
目前流式荧光最瞩目的应用是细胞因子，这是这三年临床流式取得较快发展的第二个原因。根据法规规定，试剂盒需要注册，旷博、唯公、瑞斯凯尔、重庆博生特、赛基、湖南拜恩美等6家公司走在前面。
细胞因子的应用应当不局限于Th1/Th2/Th17等6因子，7因子乃至12因子检测。这三年，比较重要的进展在于
赛基生物推出三款细胞因子试剂盒：
首款炎症因子四联检试剂盒；
肿瘤免疫评估六因子联检；
趋化因子联检，免疫细胞诱导剂的监测。
美瑞特推出移植物抗宿主病（GVHD）六因子试剂盒，包括IL-6、IL-8、ST-2、TNFR1、REG3α、Elafin，据信在注册之中。
目前主要的商品流式分选仪见下表。
这三年，分选流式的发展呈现了这样几个趋势：
减少对细胞损伤，许多公司采用微流控芯片，低压分选等；
光谱分选仪，如BD公司的FACSDiscover S8，Thermofisher公司的BigFoot，Cytek公司的Aurora CS的光谱分选仪；
实时成像，如BD公司的FACSDiscover S8 和Union Biometrica的COPAS Vision ；
细胞拉曼散射，无需标记，如国内星赛生物公司的FlowRACS；
笔者建议的方向有二：1）把流式分析做到极致，如Beckman Coulter公司2020年12月发布CytoFlex SRT，分选出来的细胞就是有价值的；
2）把分选踏踏实实作为一个故事的终点，另一个故事的起点。花这么多钱买台分选，是为了把分选出来的细胞干出别的活来，比如最近十分热门的单细胞测序，能否在分选那一刻就考虑到测序的需要？
商品流式细胞仪是从分选仪开始，希望分选流式“以终为始”，真正成为流式皇冠上的明珠。
| 公司 | 型号 | 分选参数和其它特点 |
| BC | Moflo Astrios EQ | 32C-7L，空气激发，6路 有效分选速度＞70,000 EPS |
| CytoFLEX SRT | 15C-4L | |
| BD | FACSDiscover S8 | 全光谱+图像，5激光，6路 |
| FACSymphony S6 | 28C-9L，6路 | |
| FASCAria Fusion | 18C-5L | |
| FACSAria III | 18C-4L | |
| FACSMeoldy | 9C-3L | |
| Bio-Rad | S3e | 4C |
| Cytek | Aurora CS | 全光谱-5L，6路 |
| Cytonome | Viva | 研究型 |
| Hydris | 大规模细胞生产 | |
| Gigasort | 微流控，细胞治疗 | |
| Mitenyi | MACSQuant Tyro | 8C-3L，微流控 |
| Namocell | PALA | 11C-2L，微流控 |
| HANA | 2C-1L，微流控 | |
| Nanocellect | WOLF G2 | 9C-2L，微流控 |
| WOLF | 3C-1L，微流控 | |
| 诺海 | NH21 | 18C-4L |
| On-chip | On-chip Sort | 6C-3L，微流控 |
| Sony | MA900 | 12C-4L，微流控 |
| SH800s | 6C-4L，微流控 | |
| FX500 | 6C-3L，微流控，可更换流路 | |
| Thermo | BigFoot | 全光谱-9L，兼容传统补偿模式 空气激发，6路，虚拟18路 分选速度＞70,000 EPS |
| Union Biometrica | COPAS FP | 3C，微粒光密度、轴向长度 气流分选，~1500μm |
| COPAS infinity | ||
| COPAS Vision | 在以上型号基础上加实时明场成像 | |
| BioSorter | 可更换流路和光学组件 | |
| 纬冉 | SE309 | 18C-4L |
| SE206 | 4C-2L | |
| 星赛 | FlowRACS | 拉曼光谱，微流控 |
在体流式中国首发
图片来自生物谷
UB公司的气流分选COMPAS Vision Thermo Fisher公司2021年6月发布Invitrogen Attune CytPix，在4激光14色，及特有的声波聚焦流式基础上，同时捕获高分辨率的明场图像，6000张/s，0.3μm/pixel，分辨率0.6μm，检测限0.8μm，结合形态学和荧光产生新的分析方法...... BD公司2022年发布的FACSDiscover将全光谱分选流式和图像分析结合在一起，能够以每秒15,000个细胞的速度捕获流经系统的单个细胞的图像。
重庆微浪生物的FlowUltron-R100，采用专利的微流换液装置，免除了离心过程，据称细胞保存率高，细胞活性高，降低染色背景。这一改进措施对自动化的最大意义是容易实现操作。 Curiox公司的AUTO 1000层流洗涤技术取代传统的离心洗涤，每个样品板包含一系列亲水点，悬浮细胞可以通过重力停留在这些点上。每个点周围的材料都是高度疏水。每个点可以将多达 1000 万个细胞清洗成单个细胞。卡塔尔43色文章据称也采用了这一技术。 赛基生物 CGFlowStar流式全自动样本处理系统，集加样、移液、孵育、离心等步骤。
最后一个问题，流式的市场容量到底有多大？这是最近被问到比较多的问题。
笔者的回答是，首先要看你自己的目标是几个小目标？
Markets & Markets每年说法在变，2021年流式细胞仪的全球市场达43亿美元，预计2026年达63亿美元，CACR为8.1%。
国内数据，BC& BD应该已经超过3亿美金，其它品牌加起来在1亿美金左右.....欢迎留言。
