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审阅︱唐淳
点评︱王华丽（北京大学第六医院国家精神疾病医学中心），王立明（湖南大学生命医学交叉研究院），沈汉明（澳门大学健康科学学院）
责编︱王思珍
泛素（Ubiquitin）是真核细胞中高度保守的蛋白质，通过共价修饰底物蛋白质（被称为泛素化修饰）、非共价与靶蛋白结合，参与几乎所有细胞生命活动，其调控异常与神经退行性疾病、肿瘤等疾病密切相关。在中枢神经系统，泛素依赖的蛋白酶体降解系统（Ubiquitin-dependent proteasomal system，UPS）对于维持神经元蛋白质稳态至关重要，UPS降解活性进行性下降即是神经元退行性变化的主要特点，也是促进神经元退行性变化进展的重要原因。大量研究显示，在衰老及相关的神经退行性疾病发生发展过程中，由于蛋白酶体组成单元的表达下降、ATP水平下降、Ab聚集等各种诱因，可导致蛋白酶体活性下降、蛋白质聚集，进而损伤神经元。然而，在神经退行性变化过程中，UPS活性为何持续进行性下降，了解较少。此外，泛素的Ser65位点能够被PINK1（PTEN-induced kinase 1）磷酸化，有研究发现在老年和帕金森病患者，脑内神经元磷酸化泛素显著增加，但对磷酸化泛素的生物学作用，除参与线粒体自噬外，研究甚少。近期，浙江大学基础医学院张纬萍副教授和北京大学化学与分子工程学院/生命科学中心唐淳教授在eLife在线发表了题为“Elevated Ubiquitin Phosphorylation by PINK1 Contributes to Proteasomal Impairment and Promotes Neurodegeneration”的研究论文，揭示了脑衰老和神经退行性疾病中，磷酸化泛素增加的来源，以及抑制UPS活性，促进神经元退行性变化的作用及机制。研究表明，由于各种原因引起蛋白酶体活性下降，使PINK1降解减少，可以增加磷酸化泛素水平；泛素被磷酸化，可以抑制底物的泛素化，以及泛素化底物与蛋白酶体的结合，进一步降低UPS降解能力。蛋白酶体活性降低—pUb水平增加—UPS降解能力进一步下降，形成正反馈通路，导致UPS活性持续进行性下降，导致神经元内蛋白质聚集，损伤线粒体，促进神经元退行性变化。该研究揭示了与多种诱因相关的神经元退行性变化的普遍机制，为保护神经元提供了新的潜在药物靶标，对靶向UPS药物（如PROTACs）的作用有重要影响。
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泛素Ser65经PINK1磷酸化，合作课题组长期研究磷酸化泛素（pUb）的结构与功能[1-3]，提出了泛素磷酸化能够影响泛素的稳定性、重构泛素信号系统的观点[4]。然而，PINK1在细胞中分布在线粒体外膜，线粒体膜电位正常时，可被PARL水解后产生sPINK1，sPINK1通过N-末端规则被泛素蛋白酶体系统降解，因此在生理条件下，PINK1和pUb的水平极低。研究显示，线粒体损伤后可增高PINK1水平，而蛋白酶体活性下降增加sPINK1水平，两者均能够提高细胞内pUb的水平，有研究显示PD患者脑内pUb水平明显增加。该研究进一步发现脑衰老、阿尔茨海默病人和小鼠脑内、缺血性损伤的小鼠脑内及细胞，均可见pUb水平显著增加（图1）。提示pUb水平增加是脑衰老、急慢性神经退行性疾病中的普遍现象。图1 磷酸化泛素增加是脑衰老及相关神经退行性疾病的普遍现象进一步，通过过表达sPINK1提高pUb的水平，发现能够诱导蛋白质聚集，采用激酶活性缺失的sPINK1-KD过表达，未见蛋白质聚集，提示该作用与sPINK1的激酶活性相关，采用细胞水平检测蛋白酶体活性的Ub-R-GFP探针，发现具有激酶活性的sPINK1可抑制蛋白酶体降解通路（图2A-D）。在HEK293细胞敲除pink1，发现能够减慢蛋白酶体抑制剂MG132诱导的蛋白质聚集，进一步提示PINK1调节蛋白酶体降解通路（图2E）。图2 泛素磷酸化抑制UPS降低蛋白质、诱导蛋白质聚集为研究pUb抑制蛋白酶体降解通路的分子机制，该研究首先在蛋白质和细胞水平，发现磷酸化能够抑制泛素链的形成，抑制底物的泛素化，模拟磷酸化突变的Ub/S65E同样不能形成泛素长链（图3A、3B）。制备能够在体外检测纯化蛋白酶体活性的探针（K48-polyUb-GFP），发现将泛素磷酸化后（pK48-polyUb-GFP），被蛋白酶体降解的速度显著减慢（图3C）。采用全内反射荧光显微镜单分子检测，发现pK48-polyUb-GFP与蛋白酶体的结合能力显著低于K48-polyUb-GFP（图3D-I）。图3 泛素磷酸化抑制UPS降低蛋白质活性的分子机制进一步，该研究在小鼠海马神经元过表达sPINK1，发现在过表达70天后，检测到PINK1和pUb水平显著增加。通过免疫印迹检测，发现过表达sPINK1可导致蛋白质聚集，而且，主要是低分子量蛋白质聚集，提示抑制了蛋白质泛素化/泛素链的延长。在海马神经元发现神经元突起形态改变，树突棘的数量减少，小鼠学习记忆能力降低，表明sPINK1能够诱导神经元退行性损伤（图4）。极为重要的是，过表达Ub/S65A逆转（Ub/S65A不能被PINK1磷酸化）能够逆转sPINK1产生的神经损伤作用，单独过表达Ub/S65E（模拟泛素磷酸化突变）产生与sPINK1相似的神经损伤作用（图4），这证明sPINK1诱导蛋白质聚集，促进神经元发生退行性变化的作用，是通过磷酸化泛素发生的。图4 增加小鼠海马神经元pUb水平诱导神经元退行性变化的作用最后，该文总结指出，UPS通过（1）底物泛素化，（2）泛素化底物与蛋白酶体结合，（3）蛋白酶体降解蛋白质，维持神经元蛋白质稳态。脑衰老、Ab沉积、缺血性损伤等条件下，蛋白酶体活性降低，使sPINK1积累、pUb增加，随后抑制底物泛素化和泛素化底物与蛋白酶体结合，产生恶性循环，使蛋白质聚集，损伤线粒体，导致神经元退行性损伤（图5）。图5. 磷酸化泛素抑制UPS活性诱导神经元退行性变化的机制综上所述，该研究在人脑、小鼠、细胞和蛋白质水平，揭示了脑内磷酸化泛素增高的原因及导致神经元退行性变化的作用和机制，丰富了磷酸化泛素生物学功能的研究，为保护神经元、抑制神经元退行性病变提供了潜在的治疗靶标。未来的研究需要进一步阐明pUb如何影响泛素介导的信号系统；系统研究pUb在脑衰老及神经退行性疾病中的作用；评估pUb增高，能否成为影响药物在年轻和老年等不同群体中作用差异的关键因素。
王华丽（教授，北京大学第六医院 国家精神疾病医学中心）蛋白质泛素化是一种重要的翻译后修饰过程，改变底物蛋白质的功能、活性或稳定性，从而在细胞内蛋白质降解、信号传导、DNA修复等生理过程中发挥关键作用。阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）和路易体痴呆（DLB）等常见的神经退行性疾病病因未明，但学界普遍认为大脑内某些蛋白质的异常聚集和沉积是其重要病生理机制，如与AD相关的β-淀粉样蛋白（Aβ）和tau蛋白，与PD和DLB相关的α-突触核蛋白（DLB）。其中，蛋白质泛素化机制失常，无法识别或降解错误折叠的蛋白质，有可能导致神经元内蛋白质稳态失衡，造成病理蛋白聚集，促使神经退行性改变。该研究揭示了泛素的磷酸化水平上升与PINK1功能丧失之间的潜在关联，并进一步探讨了持续性的磷酸化泛素水平升高如何通过抑制蛋白酶体降解过程，进而损害依赖于泛素的蛋白酶体系统（UPS），最终可能导致神经退行性疾病的发生。这一研究发现为阿尔茨海默病、帕金森病、路易体痴呆等神经系统退行性疾病早期诊断和治疗的转化医学研究提供了新的视角。大量研究显示PINK1功能丧失可抑制自噬（尤其是线粒体自噬）影响细胞内蛋白质和细胞器稳态，而该研究显示PINK1表达和活性持续增强可磷酸化泛素水平间接影响细胞内蛋白质平衡，提示或许可通过监测PINK1基因的多态性以及磷酸化泛素水平，对神经退行性疾病发生风险进行预判。同时，由于磷酸化泛素水平升高，可以抑制底物的泛素化，在正反馈通路影响下，导致神经元内蛋白质聚集，损伤线粒体，促进神经元退行性改变。因此，基于该研究所提出的假说，辉瑞公司已经在开发基于磷酸化泛素的单分子检测方法，作为识别帕金森病和路易体痴呆等疾病提供具有特异性的分子标志物。该研究通过一系列实验发现磷酸化泛素通过抑制蛋白酶体降解通路而造成蛋白质聚集，促进神经元退行性改变。这一发现促使我们思考，抑制泛素磷酸化可增强蛋白酶体功能，来对抗累积的蛋白毒性效应，这提示泛素磷酸化不仅是一个标志物，或许可以作为新药研发的一个方向。例如，调控PINK1的药物，不仅需要激活剂，也需要抑制剂，后者或许可抑制神经退行性疾病中磷酸化泛素的积累，恢复受损的细胞内蛋白酶体系统，加速病理蛋白的清除，延缓病理进程，从而为多种神经系统退行性疾病提供新型疾病治疗新药。
王立明（教授，湖南大学生命医学交叉研究院），沈汉明（教授，澳门大学健康科学学院）
神经元的不可逆性丢失及其引发的认知与运动功能障碍是神经退行性病变的典型特征。此外，神经退行性病变还常伴随蛋白质降解机制受损的现象，其中蛋白质的泛素化-蛋白酶体降解通路功能降低，导致泛素化修饰蛋白的不断积累，进而引发神经毒性。既往研究显示，在神经退行性疾病患者的脑组织样本中，磷酸化泛素（pUb）水平普遍显著升高。然而，pUb在神经退行性病变发生发展过程中的具体作用机制仍不清楚。
近日，浙江大学医学院张纬萍团队及北京大学唐淳团队在《eLife》上发表了一篇题为“Elevated Ubiquitin Phosphorylation by PINK1 Contributes to Proteasomal Impairment and Promotes Neurodegeneration”的重要文章，在泛素与神经退行性疾病发生机制的研究领域取得了重要的进展。该研究深入探讨了蛋白酶体与泛素之间的相互作用及其在神经退行性疾病中的关键角色，揭示了一个全新的前馈环路：蛋白酶体功能的抑制导致磷酸化泛素（pUb）水平上升，而pUb水平的持续升高进一步削弱了蛋白酶体的降解能力，形成恶性循环，加速了神经退行性疾病的进程。
研究团队发现，pUb在多种神经退行性疾病中普遍存在高表达现象。实验结果表明，蛋白酶体抑制会导致sPINK1（PINK1的细胞膜片段）积聚，进而促进泛素的磷酸化修饰。升高的pUb会干扰泛素链的正常延伸，影响蛋白酶体与底物之间的相互作用，从而削弱蛋白酶体对蛋白质的降解功能。与之形成鲜明对比的是，当敲除小鼠的PINK1基因后，显著减轻了衰老及其相关退行性病变的表型。此外，研究团队进一步发现，在小鼠海马神经元中特异性表达sPINK1会导致pUb表达水平显著升高，并伴随蛋白质聚集、蛋白质稳态失衡、神经元损伤、神经炎症及认知障碍等一系列病理表现。进一步的研究表明，表达Ub/S65A磷酸化缺失突变体能够逆转相关的神经损伤，而表达Ub/S65E磷酸化模拟突变体则会加重神经损伤的程度。
现有的文献认为，由PINK1 介导的的泛素磷酸化过程，是调控线粒体自噬的一个重要机理。PINK1功能激活和泛素磷酸化水平的升高会降低神经退行性疾病的发病机会。但本研究从另外一个角度，提出了一个全新的神经退行性病变的致病机制，同时还证明pUb介导的反馈环路是一个极具潜力的治疗靶点。该发现具有重要的科学意义和潜在的临床应用价值，为未来神经退行性疾病的治疗提供了新的思路和方向。
原文链接：https://elifesciences.org/reviewed-preprints/103945v1#tab-content
浙江大学基础医学院张纬萍副教授和北京大学化学与分子工程学院/生命科学中心唐淳教授为该文的共同通讯作者。陈聪博士和高童谣博士生为该文的共同第一作者。本研究也得到了北京大学医学院李婷婷教授、长江大学第一附属医院易华伟博士、基础医学院卢韵碧副教授的支持。本研究获得了国家重点研发计划、国家自然科学基金、浙江省自然科学基金的资助。转载须知：“逻辑神经科学”特邀稿件，且作者授权发布；本内容著作权归作者和“逻辑神经科学”共同所有；欢迎个人转发分享，未经授权禁止转载，违者必究。
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“逻辑神经科学”微信群：文献学习
扫码添加微信，并备注：逻辑-文献-姓名-单位-研究领域-学位/职称1 Dong, X. et al. Ubiquitin S65 phosphorylation engenders a pH-sensitive conformational switch. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114, 6770-6775 (2017).2 Ye, S. X. et al. Ubiquitin is double-phosphorylated by PINK1 for enhanced pH-sensitivity of conformational switch. Protein Cell 10, 908-913 (2019).3 Hou, X. N. et al. Connecting Protein Millisecond Conformational Dynamics to Protein Thermal Stability. JACS Au 4, 3310-3320 (2024).4 Tang, C. & Zhang, W. P. How Phosphorylation by PINK1 Remodels the Ubiquitin System: A Perspective from Structure and Dynamics. Biochemistry 59, 26-33 (2020).
