长文预警！全文共2500字，阅读15分钟。
注：本文不构成任何投资意见和建议，以官方/公司公告为准；本文仅作医疗健康相关药物介绍，非治疗方案推荐（若涉及），不代表本公众号立场。任何文章转载需得到授权。
导读：2024年5月，西奈山伊坎医学院Nicolas Vabret团队在Cell子刊STAR Protocols分享实验方法：《Protocol for the development of mRNA lipid nanoparticle vaccines and analysis of immunization efficiency in mice》。文章详细描述了mRNA疫苗的制备和体内外活性评估实验步骤，包含：mRNA序列设计、体外转录（IVT）模板DNA制备、IVT mRNA制备、mRNA-LNP包封、RNA质量检测和mRNA疫苗的免疫原性评估（体外细胞和体内小鼠试验）。
前期文章中，菌菌介绍了mRNA疫苗的序列设计、mRNA转录模板、体外转录（IVT）和mRNA纯化的实验流程。感兴趣的小伙伴可查看早期文章或直接联系菌菌：133 8033 2910。
本期文章菌菌将继续分享mRNA-LNP的制备流程，包括含mRNA的水相样品准备、LNP脂质混合物准备和微流控法包封LNP-mRNA。
01
LNP脂质配制
该文章使用了一种商业化的四组分LNP试剂配方，这是一种针对T细胞递送优化的mRNA递送系统，其脂质组分及各脂质摩尔比为：可电离脂质:磷脂DSPC:胆固醇:稳定剂=50: 10: 37.5: 2.5。该Protocol中使用的总脂质摩尔浓度为12.5 mM。
文章使用的LNP配方仅限于实验研究，而3种获批用于人体的LNP配方在mRNA疫苗/药物的开发中更为常用，包括以ALC-0315（BioNTech BNT-162b2）、SM102（Moderna mRNA-1273）或D-LIN-MC3（Alnylam Onpattro）为基础的LNP。菌菌汇总了这三种LNP配方的脂质组分、摩尔比例和分子量，并列举了每种脂质的投放量，以供参考。
02
mRNA样品准备
mRNA样品的浓度取决于脂质摩尔数和氮磷比（N/P）。N/P是RNA-LNP包封中的常用参数，常用的氮磷比为4、6或者8。氮磷比的计算公式为：
关于公式的解释
磷（P）的来源：每个碱基含有一个磷酸根，1 mol的核糖核苷酸包含1 mol的磷酸基团。RNA脱水聚合后的平均分子量均值为320.5 g/mol。
氮（N）的来源：常规的四组分LNP脂质中，以可电离脂质比例计算氮原子数，每个可电离脂质包含1个氮原子（D-LIN-MC3、ALC-0315、SM-102）。以可电离脂质占比50%计算，每mol总脂质中包含0.5 mol的氮原子。注意：ALC-0315在其对应的LNP配方中占比为46.3%，需对应做出调整。
由上述公式换算得出，每摩尔（mol）总脂质包封的RNA量为：
×320.5 (g)
另外，具体的RNA使用浓度还与水相/有机相的流速比（FRR）有关。菌菌列举了不同氮磷比、FRR为3:1条件下常用的LNP脂质-RNA浓度，如下表所示：
该Protocol中使用的mRNA浓度为200 mg/mL，水相缓冲液是100 mM的商业化试剂（pH 4.0）。根据脂质摩尔浓度为12.5 mM计算得到，研究中选择的N/P约为3.34。
03
微流控包封
Precision NanoSystems（PNI）微流控设备可以实现纳米颗粒组分在纳升水平以毫秒混合，高效保证混合效果。通过结合优化、精确的泵送和独特的微流体混合特性，能够快速制备纳米药物。
Ignit是PNI Nanoassemblr平台推出的微流控混合仪，适用于LNP、脂质体等纳米药物的制备。该Protocol以Ignit微流控设备为例，详细描述了LNP-RNA包封的实验流程。
1.料液准备：按一定用量配置水相和有机相；水相包含缓冲液和RNA，有机相为一定比例的脂质混合物：阳离子脂质、中性脂质、胆固醇和PEG脂质；
2.分别将水相溶液和有机相溶液吸入3 ml注射器中，并排出注射器中的空气。将装有mRNA溶液的注射器插入"C"入口，将装有混合脂质的注射器插入"R"入口；
3.仪器设置，设置总流速（TFR）为12 mL/min、总体积2 mL、水相/有机相流速比（FRR）为3:1，初始排废体积为0.35 mL，结束排废量为0.05 mL；
4.运行仪器，并用收集管收集样品；
5.通过超滤或透析经LNP-RNA换液至特定缓冲液。
参考文献
[1] Karekar N, Reid Cahn A, Morla-Folch J, Saffon A, Ward RW, Ananthanarayanan A, Teunissen AJP, Bhardwaj N, Vabret N. Protocol for the development of mRNA lipid nanoparticle vaccines and analysis of immunization efficiency in mice. STAR Protoc. 2024 Jun 21;5(2):103087. doi: 10.1016/j.xpro.2024.103087.
加微信交流群/商务/媒体合作/转载授权，扫下方二维码
药物递送技术文献共享QQ群，扫下方二维码
本公众号长期征稿：征稿启事
