基于脂质纳米凝胶的免疫增强剂促进药物递送和抗肿瘤免疫

核酸类免疫激动剂pIC是一种强效的I型干扰素诱导剂，在激活天然免疫和诱导强效的体内抗肿瘤免疫中表现出巨大的潜力（1）。然而，游离的pIC在体内并不稳定，且细胞吞噬和胞质递送效率很低，因此无法直接进行给药。一种解决策略是将pIC与阳离子聚合物混合形成纳米复合物如poly-ICLC来同时提高其体内的稳定性、细胞吞噬能力以及胞质递送效率（2）。然而，阳离子聚合物所引发的系统毒性以及pICLC单独给药时非常有限的治疗效果同样限制了其临床应用。因此，亟待一种兼具安全性与有效性的递送策略来克服pIC所面临的这些瓶颈问题。脂质纳米颗粒（LNP）作为目前核酸递送最先进的载体之一，其较低的系统毒性与可电离脂质所介导的胞质递送效应使其成为pIC体内给药的理想载体选择（3）。然而，LNP在实体瘤中的蓄积效率始终不足1%，且胞质递送效率也不足5%，这极大地限制了核酸药物的生物学活性（4）。

为了提高LNP体系的胞质递送效率，该研究团队将一种具有潜在内吞体膜扰动能力（5）的天然阴离子聚合物透明质酸（HA）引入LNP的内部，形成了具有HA纳米凝胶内核的LNG载体用以包载pIC；与此同时，为了进一步增强该体系的免疫激活水平，研究人员向其中引入能激活cGAS-STING通路的二价锰离子（6），与pIC协同诱导I型干扰素的分泌。该团队所开发的复合免疫增强剂LNG-Mn-pIC （简称LMP）在体内能够强效地激活天然免疫细胞，并以一种免疫激活依赖的方式降低肿瘤血管完整性、重塑肿瘤细胞外基质（ECM），诱导肿瘤细胞凋亡并扩大细胞间隙，从而促进纳米粒在肿瘤部位的蓄积和渗透。这一效应能够进一步增强LMP在瘤内的肿瘤免疫激活作用，并使其在多种小鼠肿瘤模型中展现出强效的抗肿瘤治疗效果（图1）。

为了以一种稳定可控的方式将pIC与锰离子共载于LNG中，研究人员首先使用微流控装置制备了单载pIC的LNG-pIC，随后通过加热孵育（47.5℃）的工艺促进锰离子穿过脂质分子层并与纳米粒内部的pIC和HA发生交联从而形成脂质纳米凝胶复合免疫增强剂LNG-Mn-pIC（图2 A-D）。该制剂粒径均一（约80 nm），接近电中性，且表现出良好的血清稳定性和长期稳定性（图2 E-K）。

随后，研究人员探究了HA对胞质递送行为的影响。通过将罗丹明标记的pIC（Rho-pIC）与小鼠原代树突状细胞（BMDC）的溶酶体进行时间依赖的共定位成像和分析后，研究人员发现LNG载体中的HA显著地增强了pIC的内吞体逃逸（图3 C-E）。前期有研究表明HA骨架上的大量羧基能够在酸性条件下发生质子化，从而增强HA的疏水性并赋予其增加内吞体膜通透性的能力（6），于是研究人员通过吖啶橙（AO）染色的方法检测了LNG中的HA对BMDC内吞体膜通透性的影响，结果显示其的确可以显著地增加内吞体膜的通透性（图2 F-I）。

图3. LNG中的HA能够通过增强内吞体膜的通透性来促进pIC的胞质递送

随后，研究人员在体外BMDC细胞中对LMP所引发的天然免疫激活效应进行了系统地探究。锰离子和pIC分别作为cGAS-STING和RIG-I/MDA5信号通路的激动剂，研究人员发现二者能够强效协同诱导I型干扰素的分泌（图3 K-M）。除此以外，二者还能够显著协同激活大量与天然免疫相关的信号通路，增强APC细胞的成熟与抗原提呈，并促进大量促炎细胞因子和趋化因子的表达和分泌（图4 A-J）。进一步的研究发现，LMP中的锰离子可以通过显著地上调胞质RNA受体RIG-I/MDA5的表达水平、增强pIC的下游信号转导从而与其协同诱导I型干扰素的分泌（图4 K-N）。

图4. LMP中的锰离子和pIC能够强效协同激活天然免疫

图5. LMP以天然免疫激活依赖的方式增强自身在肿瘤部位的蓄积和扩散

另外，研究人员还发现，LMP静脉给药后能够强烈诱导肿瘤细胞发生凋亡，显著增大组织细胞间隙，进而促进纳米药物在瘤内的渗透和扩散（图6 A-B）。

图6. LMP诱导肿瘤细胞凋亡和肿瘤相关细胞外基质重塑

最后，研究人员在MC38结肠癌模型小鼠中证明了LMP能够在体内激活强效的抗肿瘤免疫应答，包括促进APC细胞的成熟、增强CD8+ T细胞的浸润、激活和招募NK细胞以及下调抑制性免疫细胞的比例，并能够有效地抑制MC38皮下肿瘤的生长和复发，这一治疗作用主要依赖于CD8+ T细胞（图7）。

图7. LMP在皮下肿瘤模型中显示出强效的抗肿瘤治疗作用

1. 开发了一种能够稳定装载pIC和锰离子的LNG制备工艺，并证明了LNG 内部的透明质酸能够增加内吞体膜通透性并提高核酸药物向细胞质递送的效率；
    
2. 利用LNG平台实现了cGAS-STING和RIG-I/MDA5两条信号通路之间的协同效应，克服了pIC免疫激活较低的瓶颈问题；
    
3. 系统研究了免疫激活效应对LNG在肿瘤部位蓄积的影响，并初步揭示了免疫激活影响药物递送的关键原理，提供了一种可行的抗肿瘤治疗方案，对后续抗肿瘤免疫制剂开发具有重要参考价值。

    
   

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2. H. Sultan, A.M. Salazar, E. Celis, Poly-ICLC, a multi-functional immune modulator for treating cancer, Semin. Immunol. 49 (2020) 101414.

3. J.A. Kulkarni, D. Witzigmann, S. Chen, P.R. Cullis, R. van der Meel, Lipid nanoparticle technology for clinical translation of siRNA therapeutics, Acc. Chem. Res. 52 (2019) 2435–2444.

4. L.N.M. Nguyen, W. Ngo, Z.P. Lin, S. Sindhwani, P. MacMillan, S.M. Mladjenovic, W.C.W. Chan, The mechanisms of nanoparticle delivery to solid tumours, Nat. Rev. Bioeng. 2 (2024) 201–213.

5. M. Maugeri, M. Nawaz, A. Papadimitriou, A. Angerfors, A. Camponeschi, M. Na, M. Hölttä, P. Skantze, S. Johansson, M. Sundqvist, J. Lindquist, T. Kjellman, I.L. Mårtensson, T. Jin, P. Sunnerhagen, S. Östman, L. Lindfors, H Valadi. 2019. Linkage between endosomal escape of LNP-mRNA and loading into EVs for transport to other cells. Nat Commun., 10 (2019) 4333.

6. K. Raghupathi, M. Skinner, G. Chang, C. Crawley, T. Yoshida-Moriguchi, P. Pipenhagen, Y. Zhu, L.Z. Avila, R.J. Miller, P.K. Dhal, Hyaluronic acid microgels as intracellular endosomolysis reagents, ACS Biomater. Sci. Eng. 4 (2018) 558–565.

7. Z. Zhao, Z. Ma, B. Wang, Y. Guan, X.D. Su, Z. Jiang, Mn(2+) directly activates cGAS and structural analysis suggests Mn(2+) induces a noncanonical catalytic synthesis of 2′3’-cGAMP, Cell Rep. 32 (2020) 108053.