2008年，由Yoshiki Sasai领导的研究团队首次从鼠胚胎干细胞（ESCs）和后来从人类胚胎干细胞（hESCs）中开发出三维皮质结构。这种方法通过模式化称为胚胎体（EB）的ESCs球体，形成神经上皮组织。细胞在EB内自组织形成皮质神经玫瑰花状结构。这些组织中心具有放射状结构和中心腔，代表神经管形成的体外相关物。尽管胚胎只有一个神经管，但这些三维体外模型包含多个组织中心（即玫瑰花状结构）。其他研究团队开发了类似的技术来生成所谓的人脑或大脑类器官，但在每种情况下都会形成多个玫瑰花状结构。尽管皮质类器官已被用于研究人类大脑发育、探索网络形成和神经元电生理学、模拟遗传性疾病和中枢神经系统相关的病毒感染，以及进行毒理学研究，但由于形态学变异，探索皮质类器官中的结构变化具有挑战性。类器官中看到的结构异质性和多个组织中心（神经玫瑰花状结构）在某些非神经类器官系统中并不存在。例如，肠道和胰腺类器官具有围绕它们组织的单一腔结构。这些方法之间的一个主要区别是，非中枢神经系统类器官通常从二维（2D）多能干细胞培养开始，然后通过在细胞外基质（ECM）蛋白的厚水凝胶上进行3D诱导。类似地，体内神经发育始于神经板的模式化，这是一种二维结构，随后通过神经管形成形成三维神经管。因此，研究人员假设从二维神经上皮（Chambers等人，2009）开始类器官形成将产生具有单个神经玫瑰花状组织中心的类器官。为了实现单玫瑰花状类器官，其他研究团队使用ECM水凝胶的微图案化或从二维培养中手动分离。然而，研究人员寻求一种更易于获取和可扩展的技术。他们开发了一种方案，通过切割双SMAD抑制剂分化的小块、等大小的神经上皮，并将其转移到Geltrex（一种类似ECM的材料）上。他们发现类器官迅速自组织形成具有单个中央腔的腔室中心表达顶端标记。他们将这些结构称为自组织单玫瑰花状皮质类器官（SOSR-COs），符合新的共识命名指南（Pașca等人，2022）。早期SOSR-COs（第6-20天）的大小和结构的一致性允许对模拟神经管缺陷（NTD）类化学致畸效应和由镶嵌表达原钙粘蛋白-19（PCDH19）引起的遗传性神经发育障碍进行精细测量。在后期时间点，SOSR-COs继续在皮层发育期间发生的内外层化，并表达正常深度和表层皮层神经元的标志物，随后是星形胶质细胞。
图1展示了从二维到三维转变产生的SOSR-COs，这些类器官表现出早期皮层发育的特征。图中详细描述了SOSR-COs分化时间表，展示了不同阶段的显微照片，包括神经上皮单层、单层切割、早期SOSR-CO形成以及在第14天的悬浮SOSR-CO。此外，通过免疫染色技术，展示了第6天、第8天和第13天的SOSR-COs的全细胞图像，突出了神经标记物的表达，如ZO-1、PKC-z、TPX2和细胞骨架蛋白。正交截面的共聚焦显微镜图像显示了SOSR-COs的三维结构，这些结构大致呈球形。第22天的SOSR-COs通过双皮质素（DCX）启动子驱动的mCherry表达显示了外周均匀分布的神经发生层，而内部的VZ样区域则由PAX6+细胞和磷酸化维门蛋白标记的分裂放射状胶质细胞（RG）组成。这些图像共同揭示了SOSR-COs在模拟人类皮层发育过程中的细胞和结构组织。
图2展示了SOSR-COs在不同发育阶段表现出与人类皮层发育一致的神经发育分层模式。三周、四周和六周的SOSR-COs通过免疫染色展示了放射状胶质细胞标记物PAX6和中间前体细胞标记物TBR2的表达。四周的SOSR-COs中FOXG1和深层神经元标记物CTIP2的表达显示了前脑标记物的表达。不同时间点的SOSR-COs通过Reelin、ZO1和HOPX的免疫染色显示了典型的Cajal-Retzius细胞的分布。六周时，SOSR-COs观察到许多表达深层皮层标记物CTIP2的细胞，以及更表层的SATB2+细胞。五个月时，SOSR-COs表现出CTIP2+和SATB2+细胞层的清晰分离，类似于其他类器官协议和发育中的人类胎儿大脑，上层神经元标记物BRN2和CUX1主要在SATB2+层的外围表达。这些结果表明，SOSR-COs模型在模拟人类皮层发育过程中显示出发育调控的时间和定位的皮层层标记物。然而，由于单玫瑰花状结构在大约一个月后丢失，层厚度在器官内部和器官间是可变的。值得注意的是，具有最高保真度的神经发育规范层出现在SOSR-COs的外部持续表达Reelin+细胞，这与这些细胞在正常“内向外”皮层发育中的重要性一致。
图3通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）显示了1个月大的SOSR-COs的细胞类型多样性和基因表达模式。UMAP（Uniform Manifold Approximation and Projection）图展示了不同细胞群体的聚类和标记基因的表达，揭示了从放射状胶质前体细胞（RG progenitors）到Cajal-Retzius细胞等多种类型的细胞。图中显示了不同SOSR-COs之间的细胞类型分布和基因表达的一致性，并通过颜色编码标识了各个细胞群的特定区域，显示出发育中的大脑皮层的细胞类型分布。这些结果表明，SOSR-COs能够在早期阶段形成多种不同的神经细胞类型，并且具有较高的细胞类型多样性和基因表达的一致性。
图4通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）展示了3个月大的SOSR-COs的细胞类型多样性和基因表达模式。UMAP（Uniform Manifold Approximation and Projection）图显示了不同细胞群体的聚类和标记基因的表达，揭示了从放射状胶质前体细胞（RG progenitors）到各种类型的神经元和星形胶质细胞的细胞类型。图中显示了不同SOSR-COs之间的细胞类型分布和基因表达的一致性，并通过颜色编码标识了各个细胞群的特定区域，显示出发育中的大脑皮层的细胞类型分布。这些结果表明，SOSR-COs在3个月时已经成熟并展现出与人类皮层发育一致的细胞类型和分层，证明了其在模拟人类神经发育和疾病模型中的潜在价值。
图5通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）展示了5个月大的SOSR-COs的细胞类型多样性和基因表达模式。UMAP（Uniform Manifold Approximation and Projection）图显示了不同细胞群体的聚类和标记基因的表达，揭示了从放射状胶质前体细胞（RG progenitors）到各种类型的神经元和星形胶质细胞的细胞类型。图中显示了不同SOSR-COs之间的细胞类型分布和基因表达的一致性，并通过颜色编码标识了各个细胞群的特定区域，显示出发育中的大脑皮层的细胞类型分布。这些结果表明，SOSR-COs在5个月时继续展现出与人类皮层发育一致的细胞类型和分层，并且越来越成熟，具有更复杂的细胞类型多样性和电生理活性，这进一步证明了其在研究人类大脑发育和疾病模型中的潜力。
图6展示了SOSR-COs（自组织单玫瑰花状皮质类器官）在暴露于致畸化合物时产生的形态变化，特别是扩大的腔室。研究人员通过向培养基中添加Rho激酶抑制剂Y-27632或非肌性肌球蛋白抑制剂blebbistatin，观察到SOSR-COs在2D到3D转换过程中的细胞结构变化。这些化合物的暴露导致SOSR-COs的紧密连接和微管网络结构发生紊乱，腔室面积显著增大。此外，研究还发现，使用已知的神经致畸药物丙戊酸（valproic acid）处理SOSR-COs会剂量依赖性地增加腔室面积，而其非致畸衍生物valnoctamide（VCD）则没有这种效果。这些发现表明SOSR-COs能够模拟人类神经管缺陷（NTDs）的形成机制，为研究和筛选可能影响神经管正常发育的药物提供了一个有力的平台。
图7展示了SOSR-COs在模拟遗传性神经发育障碍时重现的异常细胞分离现象。研究人员利用CRISPR基因编辑技术生成了PCDH19基因敲除（KO）的男性细胞系，并与等量的野生型（WT）细胞混合，模拟了携带PCDH19突变的马赛克个体。结果显示，与多玫瑰花状脑类器官相比，SOSR-COs在第20天时明显表现出细胞分离，形成了仅包含WT或仅包含KO细胞的分离条纹。这种分离现象在多个独立实验中得到了一致的验证，表明SOSR-COs能够准确模拟与PCDH19相关的遗传性神经发育障碍中的早期细胞分离现象，为研究这类疾病的机制提供了一个有力的体外模型。
本研究开发了一种从人类多能干细胞生成自组织单玫瑰花状皮质类器官（SOSR-COs）的技术，这些类器官在早期具有可重复的尺寸和结构，并在5个月的培养过程中展现出与人类皮层发育一致的细胞多样性和分层特征。SOSR-COs在模拟化学致畸剂暴露或遗传性神经发育障碍时表现出显著的结构表型，证明了其在研究人类大脑发育和疾病模型中的潜力。此外，SOSR-COs还成功模拟了神经管缺陷（NTDs）的形成机制，以及PCDH19基因突变相关的马赛克细胞分离现象，为研究早期神经发育疾病提供了一个可靠的平台，并为未来的精准治疗试验提供了可能。
