肝再生能力不足是肝切除术患者肝功能衰竭甚至死亡的首要原因，目前尚无有效的干预策略。因此，确定有效的干预措施来增强肝脏再生是优化临床结果的关键。最近的研究表明，迷走神经切断术对肝部分切除术后的肝脏再生有抑制作用，从而证实了迷走神经在肝脏再生过程中发挥的关键作用。近年来，电针(EA)已成为一种非侵入性的刺激迷走神经的技术。然而，EA对肝再生的影响仍不确定。在这项研究中，利用70%肝部分切除(PH)小鼠模型来研究EA对急性肝再生的影响并阐明其潜在的分子机制。我们观察到，EA作用于迷走神经背运动核ST36个急性激活的胆碱能神经元，导致肝迷走神经末梢乙酰胆碱释放增加，随后激活肝巨噬细胞中IL-6信号。最终，这些事件促进了肝细胞增殖，促进了肝脏再生。这些发现为EA促进肝再生的脑-肝轴机制提供了新的见解，为肝切除术后肝再生疾病的治疗提供了新的途径。
1.导言
肝脏表现出非凡的再生能力，在毒素或部分手术切除引起的肝组织损失的情况下，剩余的肝细胞会进行大量增殖，以恢复肝脏原有的重量和功能。[1]鉴于中国仍然面临着肝病的高患病率和相当数量的患者，肝脏切除术和移植仍然是终末期肝病的主要治疗方式。[2]尽管肝脏具有强大的再生能力，但仍有相当比例的患者因再生能力受损而预后不良，导致肝功能衰竭，甚至死亡。例如，在急性(如对乙酰氨基酚)或慢性胰岛素(如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或非酒精性脂肪性肝病)损伤肝脏的情况下，其再生潜力大大降低。[3]因此，确定一种有效的干预策略来促进肝脏再生对于改善临床结果至关重要。肝脏再生代表了人体多系统相互作用背景下一个复杂而精心安排的生理和病理过程。[4]以往的研究主要集中在研究与肝再生相关的炎症介质、生长因子、代谢调节和免疫反应等因素。[5]然而，对于肝脏起源以外的外部因素，特别是与神经系统有关的因素，在调节肝脏再生中的作用，我们知之甚少。最近发表的研究概述了我们目前对肝神经系统发育的理解，以及它对肝脏再生和疾病的影响。肝脏的神经支配包括自主神经纤维以及来自交感神经和副交感神经的感觉纤维，它们在损伤或疾病状态下复杂地调节各种方面，包括肝功能维持，促进器官本身的再生过程。[6]文献表明迷走神经分支切开术对PH值后的肝脏再生有抑制作用，特别是在再生过程的早期阶段。[7]本文提供的证据表明，神经系统，特别是迷走神经，在肝脏再生的复杂过程中起着关键作用。
针灸和电针(EA)是中医不可或缺的组成部分，其治疗效果已被临床验证了数千年。根据世界卫生组织(世卫组织)的《2014-2023年传统医学战略》，针灸在183个国家和地区得到广泛利用，大量高质量的临床研究证实了其在不同应用中的有效性。[8]有报道称，EA应用于后肢ST36穴位，可刺激小鼠迷走-肾上腺轴，从而发挥抗炎作用。[9]近年来，EA作为一种无创的迷走神经治疗技术的应用已经出现stimulation。[9b,10]此外，迷走神经的活动被认为可能在针灸治疗中起到中介作用。[11]然而，EA对肝再生的影响仍不确定。本研究以70%肝部分切除(PH)小鼠为实验模型，研究EA对急性肝再生的影响，并阐明其潜在的分子机制。我们发现，EA在ST36处急性激活迷走神经背运动核(DMV)的胆碱能神经元，导致肝迷走神经末梢乙酰胆碱释放增加，随后激活肝巨噬细胞中的IL-6信号，最终促进肝细胞增殖和肝脏再生。阐明了脑肝轴在EA促进肝再生作用中的根本机制，为肝切除术后肝再生疾病的治疗提供了新的途径。
2. 结果
2.1. ST36穴EA显著促进70%肝部分切除小鼠肝再生
EA的频率为2/100 Hz，强度为0.5 mA，每天15分钟，持续5天。我们采用70% PH模型，专门针对后肢st36穴位研究EA对肝脏再生的影响(图1A)。与PH组相比，EA组的肝体重比更高，在PH后48小时没有观察到明显的差异(图1B)。此外，EA组在PH值后48小时的谷丙转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平较低，表明肝功能得到改善(图1C)。与假手术小鼠相比，在PH后24和48小时，EA小鼠的ki67阳性肝细胞均显著增加(图1D)。随后，通过对增殖细胞核抗原(PCNA)的蛋白表达分析，也得到了类似的结果(图1E)。值得注意的是，与假手术动物相比，在PH后24和48小时，ea处理动物肝脏中的PCNA以及Cyclin A2、Cyclin B1、Cyclin D1和Cyclin E1基因表达均显著上调(图1F)。这些结果共同表明，EA在进行涉及去除70%肝组织的手术后，对促进肝脏再生具有显着作用。
图1所示。研究了EA对70%肝部分切除小鼠肝再生的影响。A)电针和小鼠70%肝部分切除的程序。B)术后0、24、48、72 h测量肝/体重比,比较PH和EA+PH组。C)观察两组患者术后不同时间点谷丙转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）水平，评价肝功能。D)免疫组化染色检测Ki67细胞的增殖情况在术后不同时间点PH和EA+PH小鼠的肝脏中。标尺，20 μM。E)采用Western blot分析测定PCNA术后不同时间点肝组织蛋白表达水平。F) PCNA、CyclinA2、CyclinB1、CyclinD1和在ph值为70%后的不同时间点，通过qpcr检测肝脏中的CyclinE1基因。n = 5。数据以mean±SD表示。*, P <；0.05;**，P & lt;0.01 * * *;P & lt;0.001. 上述实验重复了三次。
2.2. EA通过激活脑DMV乙酰胆碱能神经元促进肝脏再生
为了研究潜在的肝-脑连接，我们将霍乱毒素亚单位B (CTB)注射到肝脏，并在一周后追踪到大脑，在胆碱能神经元丰富的DMV区域观察到荧光信号，[12]我们观察到荧光信号与抗胆碱乙酰转移酶(ChAT)抗体共定位(图2A-C)。结果表明，迷走神经区背侧运动核内的乙酰胆碱神经元对肝神经有直接的调节作用。此外，EA增加了DMV中c-Fos的表达，与ChAT荧光信号一致(图2D)。电生理记录显示，与假手术小鼠相比，EA作用下小鼠DMV神经元的尖峰数量显著增加(图2E,F)。为了验证Ach神经元对肝脏再生的影响，我们采用化学发生抑制的方法，将AAV-hSyn-DIO-hM4D(Gi)-EGFP病毒和对照病毒(AAV-DIO-EGFP)注射到DMV区域，抑制神经元放电(图3A)。70%部分肝切除后，c-Fos免疫荧光和电生理记录证实了抑制作用(图3B-D)。PH后48 h, hM4Di+PH+EA组和hM4Di+PH组的肝/体重比和Ki67和PCNA蛋白表达水平相似，表明EA通过激活脑DMV区乙酰胆碱能神经元促进肝脏再生(图3E-G)。
图2。EA激活脑DMV区乙酰胆碱能(乙酰胆碱)神经元。A)注射CTB示意图。B)脑DMV区CTB荧光投影。比例尺，100 μm;比例尺，40 μm。C)脑DMV区CTB信号与ChAT荧光共定位的代表性图像。比例尺，50 μm;比例尺，10 μm。D) DMV中c-Fos和ChAT荧光共定位的代表性图像，以及c-Fos阳性细胞的数量。比例尺，20 μm。E,F) DMV神经元尖峰数电生理记录。N = 5。数据以mean±SD表示。***， p < 0.001。以上实验重复三次。
图3。对DMV区Ach神经元进行化学抑制后，EA对肝脏再生的影响被消除。A)化学示意图遗传学和化学发生实验时间表。B，C) 70% PH后48 h EGFP+PH+EA和hM4Di-EGFP+PH+EA小鼠C - fos抗体的DMV免疫染色和C - fos +神经元定量。标尺，20 μm。D) DMV神经元的样迹和动作电位数据。E) PH = 70%后48 h肝/体重比PH、PH+EA、hM4Di+PH、hM4Di+PH +EA组。F) PH = 70%后48 h四组肝组织PCNA蛋白表达及相关蛋白表达分析。G)四组Ki67在70% PH后48 h的免疫组化染色及Ki67阳性细胞的定量。标尺，20 μM。数据为平均值±SD。n, P >；0.05;**, P <；0.01 * * *;P & lt;0.001. 上述实验重复了三次。
2.3. EA直接通过迷走-肝脏而不是其他途径发挥促肝再生作用考虑到肝脏将乙酰胆碱神经元投射到大脑，我们研究了乙酰胆碱神经元在肝脏中的表达。我们的研究结果显示，通过免疫荧光和质谱测定，假手术组和PH组之间的肝脏乙酰胆碱含量水平相当。如图4A所示，ChAT阳性纤维位于肝实质内，与肝巨噬细胞(F4/80阳性细胞)密切接触。然而，有明显的增加PH+EA组肝脏乙酰胆碱含量的变化(图4A,C)。相反，免疫荧光和质谱结果显示，假手术组、PH组和PH+EA组肝脏内去甲肾上腺素(交感神经分泌)的表达没有差异(图4B,D)。与这些观察结果一致，western blot分析也证实PH+EA组的ChAT蛋白表达高于PH组和假手术组;然而，TH蛋白表达没有明显变化(图4E)。为了进一步研究迷走神经信号的作用，我们评估了电针对小鼠肝支迷走神经切断术(HV)后肝脏再生的影响。Western blotting分析、质谱测量、免疫荧光染色和qPCR结果共同表明，HV后，作为乙酰胆碱能神经元标志物的ChAT表达显著降低(图5B-E)。与先前的研究结果一致，我们观察到与PH组相比，PH+EA组的肝脏/体重比更高;然而，HV+PH+EA组与HV+PH组之间没有差异(图5F)。此外，对增殖相关标志物PCNA和Ki67的评估也产生了类似的结果:与仅PH组相比，PH+EA组中PCNA和Ki67的蛋白表达显著增加;而在HV+PH+EA组和HV+PH组之间，它们的表达保持相似(图5g - 1)。为了进一步验证交感神经的功能，给小鼠注射神经毒素6-羟多巴胺(6-OHDA)诱导化学交感神经去神经(图6A)。免疫荧光染色和western blot检测显示，6-OHDA几乎完全耗尽肝脏交感神经末梢(图6B,C)。此外，小鼠进行70% PH模型，我们发现PH不加EA的6-OHDA小鼠在PH 48 h后肝脏/体重比高于PH小鼠(图6D)。Western blot和免疫荧光染色结果显示，6-OHDA+PH+EA组PCNA和Ki67蛋白的表达明显高于6-OHDA+PH组(图6E、F)。以上结果表明，70% PH后，EA通过激活迷走神经而非交感神经促进肝脏再生。
据报道，EA通过迷走-肾上腺发挥全身抗炎作用axis.[9b]因此，我们旨在研究EA是通过迷走神经对肝脏再生产生直接调节作用，还是通过迷走-肾上腺轴产生间接调节作用。首先，我们使用质谱分析定量假手术组、PH组和PH+EA组的血清皮质酮水平。结果显示各组间皮质酮水平无显著差异(图S1A，支持信息)。随后，我们评估了EA对小鼠双侧肾上腺切除术(ADX)后肝脏再生的影响。质谱分析显示肾上腺切除小鼠血清皮质酮水平显著降低(图S1C，支持信息)。重要的是，当考虑肝重比和ki67蛋白表达时，ADX+PH+EA组显著高于ADX+PH组；同时，PH+EA组与ADX+PH+EA组之间的结果可比较(图S1D-F, support information)。换句话说，肾上腺切除术并没有实质性影响EA促进70% PH值后肝脏再生的能力。
图4。EA能明显激活肝脏迷走神经，但对交感神经无明显影响。PH值为70%后，假手术组、PH组和PH+EA组肝脏ChAT、F4/80 A)和TH B)免疫染色图像及统计。PH值为70%后假手术组、PH组和PH+EA组肝脏Ach C和NE D的质谱检测。E) PH值为70%后假手术组、PH组和PH+EA组肝脏ChAT和TH的Western blot图像和统计。数据为平均值±SD。ns, P > 0.05;***;P < 0.001。上述实验重复3次
图5。小鼠肝支迷走神经切断术（HV）在ph值达到70%后，消除了EA促进肝脏再生的作用分支HV。B)采用western blot检测sham组和HV组小鼠肝组织中ChAT蛋白和<s:1> - actiin蛋白的表达。C)质量PH值为70%后PH、PH+EA、HV+PH、HV+PH+EA组小鼠肝组织中Ach的光谱检测。PH值为70%后PH、PH+EA、HV+PH、HV+PH+EA小鼠ChATantibody的代表性免疫染色。标棒，20 μm。E)小鼠70% PH后48 h chat mRNA表达情况从PH、PH+EA、HV+PH、HV+PH+EA四个基团中分离。F) 48 h后PH、PH+EA、HV+PH、HV+PH+EA组小鼠肝脏/体重比70%PH. G) PH、PH+EA、HV+PH、HV+PH+EA 4组小鼠70% PH后48 h pcna mRNA表达情况。H) PCNA蛋白表达四组肝组织PH值为70%后48 h，并进行相关蛋白表达分析。I)四组Ki67在70% PH后48 h的免疫组化染色以及Ki67阳性细胞的定量。标尺，20 μm。数据为平均值±SD。n, P >；0.05;*, P <；0.05;**, P <；0.01 * * *;P & lt;0.001. 的上述实验重复了三次。
图6。交感神经切除后，70% ph EA对肝脏再生的促进作用不明显。A)小鼠6-OHDA给药示意图。B)载药小鼠和6-OHDA给药小鼠肝组织TH的Western blot检测。C)给药小鼠和6-OHDA给药小鼠TH抗体的代表性免疫染色。比例尺，20 μM。D) PH、PH+EA、6-OHDA+PH、6-OHDA+PH+EA组小鼠48 h后肝/体重比70% PH值。)western blot分析四组小鼠70% PH后48 h肝组织PCNA蛋白表达及相关蛋白表达情况。F)四组Ki67 PH值达到70%后48 h的IHC染色及Ki67阳性细胞的定量。比例尺，20 μm。数据表示平均值±SD。*， p < 0.05;**， p < 0.01。上述实验重复3次。
2.4. EA通过迷走神经促进肝再生早期巨噬细胞释放IL-6
那么迷走神经-肝脏连接的EA激活的介质是什么呢?据报道，迷走神经可以增加肝脏巨噬细胞的IL-6产生。[13]然后，我们检测了EA对70% PH后肝脏再生早期IL-6分泌的影响。我们发现，PH+EA组在70% PH后3小时血清IL-6含量显著高于PH组，而通过elisa测试，两组之间TNF - ρ含量相似(图7A,B)。更重要的是，流式细胞术和qpcr检测显示，在PH值为70%后3小时，ea处理小鼠的残肝中释放了更多的IL-6(图7C,E,F)。值得一提的是，HV后，EA对IL-6的增强作用消失(图8B、C)。然而，在70% PH后3小时，EA对残肝中TNF- rp分泌的影响很小(图7D)。众所周知，IL-6是通过STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3)信号传导发挥作用的。接下来，在PH值为70%后的3小时，通过western blot检测PH和PH+EA小鼠的肝脏STAT3磷酸化，与PH小鼠相比，PH+EA小鼠的磷酸化显著增加(图7H)，并且这种磷酸化的增强被HV减弱(图8D,E)。此外，70% PH后，EA未改变肝脏再生早期巨噬细胞数量(图7G)，中性粒细胞、T细胞和B细胞百分比无显著差异(图S2A-D，支持信息)。
图7。EA促进70% ph后早期肝再生中巨噬细胞IL-6的释放。A,B) elisa检测70% ph后3 h残肝中IL-6和TNF- rtp的分泌。C,D) 0、0、0时肝组织中IL-6和TNF- rtp基因mRNA表达。PH值70%后3 h)流式细胞术分析肝白细胞群的代表性FACS图。采用以下门控策略进行鉴定各种免疫细胞:肝巨噬细胞(CD45+F4/80+)，肝巨噬细胞分泌IL-6 (CD45+F4/80+IL-6+)。PH后3 h PH和PH+EA小鼠的IL-6+肝巨噬细胞和肝巨噬细胞的代表性FACS图，F,G)量化这些免疫细胞亚型的比例。H)肝提取物抗磷酸化STAT3、总STAT3和肌动蛋白免疫印迹的代表性图像。PH和PH+EA小鼠假手术后肝脏中磷酸/总STAT3的相对强度。数据为平均值±SD。*， p < 0.05;**， p < 0.01;***， p < 0.001。以上实验重复三次
图8。HV后，EA对IL-6的增强作用消失。A)小鼠肝支迷走神经切断术示意图。B)用elisa法检测70% PH后3h PH、PH+EA、HV+PH、HV+PH+EA小鼠残肝中IL-6的分泌情况。C) 70% PH后3h PH、PH+EA、HV+PH、HV+PH+EA组小鼠IL-6 mRNA表达情况。D,E) Western blot检测四组在PH值为70%后48 h肝组织中phospho-STAT3、total STAT3和statn−actin蛋白的表达及相关蛋白表达分析。
2.5. EA通过肝巨噬细胞介导的乙酰胆碱信号促进肝脏再生
为了进一步验证肝巨噬细胞在EA激活迷走神经促进肝脏再生过程中的关键作用，我们使用氯丙酸脂质体处理肝巨噬细胞耗尽的小鼠，检测PH后肝细胞增殖。氯膦酸脂质体显著降低肝巨噬细胞标志物F4/80的表达(图9A,B)，表明肝巨噬细胞成功耗竭。我们发现氯膦酸钠在PH值为70%后3 h时降低了小鼠血清和肝脏中IL-6的产生。值得一提的是，氯膦酸钠完全消除了EA在PH为70%后肝脏再生早期增加IL-6分泌的作用小鼠(图9C,D)。相应地，根据PCNA和Ki67的蛋白表达，氯膦酸钠给药小鼠EA对残肝促增殖的增强作用明显减弱(图9E、F)。然后，我们的目标是找到迷走神经信号激活肝巨噬细胞的关键机制。为了研究迷走神经释放的主要神经递质乙酰胆碱诱导的毒蕈碱受体信号传导是否参与其中，我们用阿托品(一种毒蕈碱受体拮抗剂)治疗小鼠，然后用ph。70% PH后，阿托品处理小鼠的PCNA和Ki67蛋白表达显著降低。有趣的是，在70% PH后3小时，阿托品处理消除了EA促进肝巨噬细胞IL-6分泌和STAT3磷酸化的作用(图10A-D)，同时，Ki67和PCNA蛋白表达水平均与上述结果一致(图10 E,F)。此外，我们还筛选了肝巨噬细胞中表达的主要乙酰胆碱受体(图S3，支持信息)，qpcr结果显示，EA显著增加了乙酰胆碱受体m2型(m2AchR)的表达。为了进一步说明这一关键作用,针对m2AchR,我们引入了一种特异性的m2AchR抑制剂。结果表明，添加m2AchR抑制剂后，EA对肝脏再生的增强作用被消除(图S7，支持信息)，提示m2AchR可能是参与迷走神经功能的主要乙酰胆碱亚型。
图9。氯膦酸钠消除了EA在小鼠PH为70%后肝脏再生早期增加IL-6分泌的作用。A)氯膦酸钠注射小鼠示意图。B) ph值为70%后小鼠肝巨噬细胞标志物F4/80抗体的代表性免疫染色和氯膦酸脂质体给药小鼠的免疫染色。C)采用elisa法检测PH、PH+EA、氯膦酸盐+PH、氯膦酸盐+PH+EA小鼠70% PH后3 h残肝中IL-6的分泌情况。PH后70% PH、PH+EA、氯膦酸盐+PH、氯膦酸盐+PH、氯膦酸盐+PH+EA小鼠70% PH后3 h IL-6 mRNA表达情况。E) western blot检测四组肝组织在70% PH后48 h PCNA蛋白表达及相关蛋白表达分析。F)四组Ki67 PH值达到70%后48 h的IHC染色及Ki67阳性细胞的定量。比例尺，20 μm。数据代表平均值±SD。ns, P > 0.05;*， p < 0.05;**， p < 0.01;***， p < 0.001。以上实验重复三次。
图10。EA促进肝脏再生依赖于肝脏胆碱能信号传导。A) A蛋白注射小鼠示意图。B)采用elisa法检测70% PH后3h PH、PH+EA、approtein +PH、approtein +PH+EA小鼠残肝中IL-6的分泌情况。C) 70% PH后3h PH、PH+ PH、approtein +PH和approtein +PH+EA小鼠IL-6的mRNA表达情况。D) Western blot检测四组小鼠PH值达到70%后48 h肝组织中磷酸化-STAT3、总STAT3和PH值为1 / 48 h时的蛋白表达情况及相关蛋白表达分析。E) western blot检测四组肝组织在70% PH后48 h PCNA蛋白表达及相关蛋白表达分析。F)四组Ki67 PH值达到70%后48 h的IHC染色及Ki67阳性细胞的定量。比例尺，20 μM。数据代表平均值±SD。ns, P > 0.05;**， p < 0.01;***， p < 0.001。以上实验重复三次。
3.实验部分
小鼠:所有实验均采用8-10周龄雄性C57BL/6小鼠和ChAT-Cre小鼠。ChAT-Cre小鼠来自杰克逊实验室(Bar Harbor, ME)。所有小鼠均在上海中医药大学动物实验中心(SHUTCM，上海)饲养。在正式实验之前，小鼠在特定的无病原体房间中进行了为期一周的适应期，并可以自由地获得标准的食物和水。所有动物实验程序均按照SHUTCM实验动物伦理委员会批准的方案进行(批准号:PZSHUTCM2306190002)。
电针程序:手术过程按照先前描述的方案[30]进行，并调整电刺激强度以引起可观察到的肌肉收缩。EA以2/100 Hz频率，0.5 mA强度，每天15分钟，连续5天在ST36穴位给予。将两根直径0.16毫米、长7毫米(0.16·7毫米，罗亚山川医疗器械有限公司，中国)的针灸针分别插入两个ST36穴的肌圈层，深度为3毫米。ST36位于胫骨前肌，髌骨与外踝之间约六分之一的距离。采用HANS-200A穴位神经刺激器进行电刺激。
手术方法:实验方法仅在8-10周龄雄性小鼠上进行。肝迷走神经切开术(liver vagotomy, HV)在腹壁上切开，胃后收，显露迷走神经前干和肝支。随后，仅用细钳切开肝支。HV术后立即行70%肝部分切除术(PH)，用6-0丝线牢固结扎并切除肝左外侧和正中叶。在假手术中，仅在腹部切开，同时保留肝脏组织和肝迷走神经分支的完整。手术完成后，使用6-0丝线对腹部肌肉和皮肤进行细致的逐层缝合。在图5A所示的实验中，在HV或HV假手术后7天进行PH测定。双侧肾上腺切除术(ADX):小鼠被麻醉，以俯卧姿势放置在解剖台上。沿着背部中线做一个后部皮肤切口，从最后一节胸椎开始延伸，露出肾脏的位置。在肾脏旁边，发现了一个肾上腺，大小约为一颗粉红色绿豆，周围环绕着脂肪组织。然后扩大皮肤切口，使用类似的技术进入并切除对侧肾上腺。动物在处理前10天给予0.9%氯化钠水进行EA治疗和肾上腺切除术后PH模型。
体内Carbachol治疗:将Carbachol (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan)溶解在生理盐水中，浓度为2 mmol l−1。小鼠腹腔注射200 nmol的carbachol (0.1 ml的2mmol l−1溶液)。给药后6小时收获肝脏。
体内阿托品处理:将复方阿托品(Sigma)溶解在含有10% v/v乙醇的盐水溶液中，使其浓度达到625 mg dl−1。小鼠从手术干预前2天开始腹腔注射阿托品，剂量为25 μgg−1体重，每天2次，直至安乐死。
免疫荧光:小鼠心内灌注4% (w/v)多聚甲醛溶液，随后在1%戊巴比妥钠过量麻醉诱导后，用30%蔗糖溶液脱水3天。抗原回收采用以下一抗在4°C孵育过夜:ChAT (1:1000, AMAB91130, Merck)， TH (1:50 00, 25859-1-AP, Proteintech)， C - fos (1:1000, 226 008, Synaptic systems)。随后，切片在室温下用荧光偶联二抗(1:1000,Ab-cam)孵育2小时。使用Olympus vs200显微镜获取图像，使用ImageJ软件(版本Fiji)进行细胞计数。
免疫组织化学(IHC)染色:肝脏样品在4%甲醛中固定至少24小时，然后石蜡包埋.并切片成厚度为4 μm的薄片。肝脏切片用二甲苯脱水，然后用分级乙醇补液。随后，切片进行抗原回收，并用3%过氧化氢处理以阻断内源性过氧化酶活性。为了减少非特异性结合，切片在4°C下用一抗孵育过夜(Ki67稀释为1:500;gb111141;Servicebio)暴露于10%正常山羊血清后。第二天，切片用PBS洗涤三次，然后用二抗孵育1小时。最后，使用Olympus vs200成像系统捕获图像。
实时定量PCR (RT-qPCR):利用HiScript II Q RT Super-Mix for qPCR (Vazyme Biotech，中国)将肝组织中提取的总RNA反转录为cDNA。采用SYBR GREEN (Vazyme Biotech，中国)实时PCR系统进行实时PCR。使用的内对照为β-actin。引物序列见表S1(支持信息)。
Western Blotting分析:使用CelLytic MT哺乳动物组织裂解试剂，添加Sigma的蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒，对肝组织进行30分钟的冷冻裂解。随后，细胞裂解液在4°C下以12,000 rpm离心15分钟。所得上清液按照既定方案进行Western blotting分析抗PCNA的一抗(1:1000,sc-7907)由Santa Cruz Biotechnology提供。抗β-actin(1:50 000, 4967)抗体由Cell Signaling Technology提供。
流式细胞术:从肝部分切除70%的小鼠肝脏中分离肝脏免疫细胞，使用Percoll (GE Healthcare，USA)在850 ×g离心纯化。剩余红细胞用Lysing Buffer (BD Biosciences，USA)裂解。随后，将肝免疫细胞与以下一抗在4°C下孵育30分钟:CD45、F4/80、IL-6、CD3、B220 (Biolegend)。所有抗体均以每次试验0.125 μg的等量进行染色。使用FACS Verse细胞分选器(BD Biosciences)测定细胞计数，并使用FlowJo软件(TreeStar)进行分析。
脑内病毒注射:为了将病毒注射到脑内，使用异氟醚对小鼠进行深度麻醉，随后将其固定在垫上的立体定向装置(RWD)中。先在头皮中线处切开一个切口，然后在颅骨上钻一个孔，方便装满病毒的玻璃移液管通过。随后，将病毒注射到DMV坐标中外侧(ML) 0.25 mm处;前后(AP) 7.5 mm;背腹侧(DV)距bregma 3.6 mm，使用输注泵(Micro 4, WPI)，连接到玻璃微电极，允许以35 nl min - 1的速度控制特定体积的病毒的递送。为了防止病毒在注射完成后传播，注射后移液管保持在原位5min。所有病毒均购自BrainVTA。在化学发生实验中，rAAV- hsyn - dio - hm4d (Gi)- egfp被递送到ChAT-Cre小鼠的DMV中，rAAV- DIO-EGFP病毒作为对照。在化学发生抑制研究中，CNO (2 mgkg−1)通过腹腔注射每天给药，连续两天。
体内电生理记录:经过一段持续3天的适应性喂养后，共将16通道电极手术植入小鼠脑DMV。使用定制的螺旋驱动微型crodriver进行多个神经元的同步记录。在进行信号记录之前，小鼠经历了至少三天的恢复期，并适应了连接在头戴式电极上的电缆。利用OmniPlex系统进行数据采集(Plexon)，同时进行所有神经记录。
液相色谱-串联质谱法(LC-MS)定量小鼠肝脏神经递质取小鼠肝组织用甲醇溶液匀浆，4℃、20000 ×g离心15 min，收集所得上清，取1 μL等分液注入LC-MS系统。检测神经递质的方法如前所述。[32]
统计分析:关于样本量、数据呈现、统计分析和显著差异的所有细节都在各自的图例中提供。实验至少进行三次，所有数据均以mean±SD表示。通过GraphPad Prism 6进行数据分析。使用非配对学生测试来检查两组之间的差异。多组间比较均采用单因素方差分析。统计分析的精确P值直接显示在各自的图上，P值< 0.05为有统计学意义。
总之，我们的研究表明，ST36处的EA可急性激活脑DMV中的胆碱能神经元，导致肝迷走神经末梢乙酰胆碱释放增加，随后激活肝巨噬细胞中的IL-6信号。最终，这促进了肝细胞增殖和肝脏再生(图11)。我们的研究结果进一步揭示了EA如何调节脑-肝轴促进肝脏再生，强调了针灸治疗是改善肝脏手术中肝脏再生障碍的有效干预措施。
图11。ST36处EA急性激活脑DMV胆碱能神经元，导致肝迷走神经末梢乙酰胆碱释放增加，随后激活肝巨噬细胞IL-6信号传导
肝脏再生过程是一种复杂而协调良好的生理现象，受到生物体的复杂调控。以往的研究主要集中在阐明肝脏中炎症介质、生长因子、代谢网络和免疫反应等因素所起的调节作用。在部分肝切除术后，机体需要启动一系列的机制来促进肝脏细胞的增殖和再生。迷走神经在这个过程中发挥着重要的作用，它可以调节炎症反应、细胞代谢等多种生理过程。而乙酰胆碱能神经元是迷走神经发挥功能的关键部分，电针作为一种传统的中医疗法，被发现可能通过调节神经 - 免疫等多种途径来影响机体的生理功能。本研究证明了ST36的EA通过激活迷走神经背运动核中的乙酰胆碱能神经元来促进肝脏再生启动。这种激活导致乙酰胆碱从肝迷走神经末梢释放，并与肝巨噬细胞胆碱能受体释放的IL-6协同作用。研究结果为肝脏疾病的治疗提供了新的思路。对于肝部分切除术后的患者，电针疗法可能是一种辅助治疗手段，可以促进肝脏再生，减少术后并发症，缩短恢复时间。将传统中医电针疗法与现代医学肝脏再生研究相结合，开辟了新的研究视角。
Yang L, Zhou Y, Huang Z, et al. Electroacupuncture Promotes Liver Regeneration by Activating DMV Acetylcholinergic Neurons-Vagus-Macrophage Axis in 70% Partial Hepatectomy of Mice. Adv Sci (Weinh). 2024;11(32):e2402856. doi:10.1002/advs.202402856
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