【成果推送】ABBS：糖尿病性心肌病的细胞死亡类型：来自动物模型的见解

摘要：全球约有十分之一的人口受到糖尿病的影响，且发病率逐年持续上升。在我国每年有140万患者死于糖尿病相关并发症。此外，约26%的糖尿病患者出现糖尿病性心肌病，心力衰竭是糖尿病患者死亡的主要原因之一。然而，临床上糖尿病心肌病的早期发现率较低，且缺乏指南及针对性的防治手段。近年来，多项研究证明糖尿病心肌细胞发生多种形式的调控性细胞死亡，包括凋亡、程序性坏死、铁死亡、铜死亡等，均与糖尿病性心肌病的病理进程密切相关。尽管大部分的研究尚处于动物实验阶段，但已经证实通过抑制这些调节性细胞死亡的过程，可以减轻或减缓糖尿病性心肌病的发生和进展。因此，本综述回顾了细胞凋亡、程序性坏死、铁死亡及铜死亡这几种新的细胞死亡形式在糖尿病性心肌病中的作用，并简要阐述了目前适用于糖尿病性心肌病的动物实验模型，希望能为今后的研究提供新的方法和思路。

关键词：糖尿病性心肌病、细胞凋亡、程序性坏死、铁死亡、铜死亡、动物模型

糖尿病（diabetes mellitus, DM）的患病率在全球范围内迅速增加，已经成为本世纪最常见的慢性代谢性疾病之一，时刻威胁着人类健康。根据国际糖尿病联盟（international diabetes federation, IDF）公布的全球糖尿病地图，到2021年20 ~ 79岁人群的全球糖尿病患病率估计为10.5%（5.366亿人），这一数字预计到2045年将上升至12.2%（7.832亿人）。其中，中国是糖尿病患病人数最多的国家，2021年我国糖尿病患病数达1.409亿，预计到2045年将达到1.744亿。2021年，全球糖尿病相关卫生支出（diabetes-related health expenditure, DRHE）估计为9660亿美元，较15年前比上升316%，预计到2045年将达到10540亿美元。其中，中国2021糖尿病相关的卫生支出为1653亿美元，仅次于美国；此外，到2045年，这一数字预计将增加到1931亿美元。

并发症是糖尿病疾病负担中不可忽视的一部分，糖尿病患者中有1/3患有心脏相关疾病，我国每年有140万患者死于糖尿病相关并发症。糖尿病患者比非糖尿病患者有更高的慢性病患病率，包括高血压、慢性冠状动脉综合征、和充血性心力衰竭（congestive heart failure, CHF）等。1972年，Rubler等提出了糖尿病性心肌病（diabetic cardiomyopathy, DCM）的概念：在没有冠状动脉疾病、瓣膜疾病和相关心血管疾病危险因素及后遗症的情况下发生的与糖尿病相关的心肌并发症。2年后，Kannel等也在对5209例糖尿病患者长达18年的随访中证实：糖尿病是充血性心力衰竭发生的独立危险因素，在调整了其他危险因素（如年龄、冠心病和高血压）后，糖尿病患者（女性5倍、男性2.4倍）心衰的发生率也更高。该论点在随后的多项研究中得到证实。2020年，Zghebi等在对逾63万人的研究中再次证明了糖尿病与充血性心力衰竭密切相关（女性OR 2.12; 男性OR 2.27）。

来自各种研究的不同数据显示，糖尿病患者中有19%-26%会发生心力衰竭(HF)，而在心力衰竭患者中糖尿病的患病率约为25% ~ 40%。DCM分为两个阶段：早期表现为左心室向心性肥厚、心肌僵硬厚度增加、心房充盈压力增加、舒张功能受损，此时可没有任何症状。晚期的特征为心肌纤维化增加，造成舒张功能进一步受损，从而出现收缩功能障碍，此时可出现明显的心衰症状，如休息时呼吸困难，活动后呼吸短促，下肢水肿，头晕、乏力、心律不齐、心绞痛等。最新研究认为DCM可能存在两种不同的表型，而不是同一疾病的连续阶段：限制型/不伴射血分数减低的心衰（restrictive/HF with preserved ejection fraction, HFpEF）和扩张型/伴射血分数降低的心衰（dilated/HF with reduced ejection fraction, HFrEF）。已有几种有效的药物治疗扩张型DCM的报道（均是按照扩张性心肌病的方式治疗），而限制性DCM的治疗有效证据仍然很少。因此， DCM被定义为以左室肥大和舒张功能障碍为特征的心肌功能障碍，且可不伴有射血分数降低。通过超声心动图发现舒张功能障碍及心肌肥厚的证据，这对DCM的早期诊断至关重要。另外，心肌活动指数（myocardial performance index, MPI）的升高作为DCM早期超声行动图变化指标，也对诊断DCM有一定的价值。

目前，关于DCM的治疗缺乏令人信服的医学证据，更无针对性临床指南报道。

要研究DCM的病理生理机制，一个稳定且具有代表性的动物模型至关重要。常用的实验动物糖尿病模型有1型糖尿病（type I diabetes mellitus, T1DM）模型和2型糖尿病（type II diabetes mellitus, T2DM）模型。两种模型在致病原理上有所不同，T1DM模型主要通过胰腺毒性的化学诱导，最常用的药物是链脲霉素（streptozocin, STZ）和四氧嘧啶（alloxan），两者皆对胰岛β细胞有特异性的杀伤作用，能够导致β细胞损伤甚至坏死，从而使动物体内胰岛素分泌减少，模拟T1DM。由于STZ和alloxan均不能在活体内诱导胰岛素抵抗，故而并不能完全模拟T2DM的病理生理。除了STZ和alloxan，还有其他化合物也具有致糖尿病作用，如灭鼠灵（vacor），二苯硫卡巴腙（dithizone），葡萄糖胶体金（goldthioglucose），麦夫胺酸钠（monosodium glutamate）等。另外，一些特异性的基因鼠也被用于T1DM的研究中，如钙调节蛋白过表达的OVE26转基因小鼠，自身免疫性糖尿病NOD（Non-Obese Diabetic）小鼠和BB（BB-wistar）大鼠等。T2DM动物模型主要由饮食构建，最常用的方法是高脂饮食（high fat diet, HFD），其特点是能够很好地模拟肥胖和胰岛素抵抗的病理过程，但由于高脂饮食动物长需要较长的喂养时间才能达到理想的血糖水平，许多研究中常用于辅以小剂量的STZ或Alloxan共同构建T2DM模型。当然，T2DM也有代表性的基因动物模型，如瘦素（leptin）缺乏的ob/ob小鼠和瘦素受体缺乏的db/db小鼠，ZDF（fa/fa）大鼠等等。值得注意的是，由于雌激素对于人类和啮齿动物糖尿病模型中潜在保护作用已被明确证实，几乎所有的糖尿病动物模型都避免使用雌性动物。

如前所述，DCM是以左心室肥厚和舒张功能障碍为特征的心肌功能障碍，可不伴有收缩功能下降和射血分数的降低（或在病程的晚期出现）。因此，有必要在DCM动物模型中复制这些类型的心脏变化。通过核磁共振及超声心动图等影像学手段，观察到动物模型中心脏舒张和收缩功能障碍都出现较早，且舒张功能障碍早于收缩功能障碍，这种进展与人类DCM的病理生理相符合。近年来，科学家们已经拓宽了他们对DCM动物模型的理解，不再仅仅考虑射血分数的降低，而是专注于早期舒张功能障碍的检测。因此，一些经典的评价舒张功能的指标，如二尖瓣血流早/晚峰值流速比（ratio of peak velocity of early to late filling of mitral inflow, E/A）， 二尖瓣血流早期充盈峰减速时间（deceleration time of early filling of mitral inflow, DT），等容舒张期（Isovolumic Relaxation Time, IVRT）均被作为DCM模型成功构建的超声检查标志之一。考虑到以上指标存在超声切面选择的主观性，相对比较客观的评价指标如心脏及左心室的质量，室间隔厚度，舒张期左室后壁（posterior wall, PW），左室短轴缩短率（LV fractional shortening, LVFS）的厚度均应列入DCM动物模型构建成功的标准。

铁死亡（ferroptosis）是一种受调控的、铁依赖的细胞死亡形式，不同于其他形式的细胞死亡，其特征是脂质过氧化和铁超载，形态学特征表现为其特征是线粒体体积变小、嵴减少、外膜凝聚或破裂。铁死亡参与感染、炎症、免疫、肿瘤、自噬等多种机制调控。在ROS和铁的作用下，细胞脂膜上的多聚不饱和脂肪酸（poly-unsaturated fatty acids, PUFAs）是受含铁酶的脂肪氧合酶（iron-containing enzyme lipoxygenase）转化，形成脂质过氧化物（lipid peroxidation），从而引起膜损伤，是铁死亡的主要启动子，其功能依靠酰基辅酶a合成酶长链家族成员4（acyl-CoA synthetase long-chain family member 4, ACSL 4）依赖的脂质生物合成的激活。

近年来，人们越来越关注开发针对铁死亡的新型心肌病治疗策略。氧化应激可以干扰细胞抗氧化能力和ROS生成之间的平衡，这是DCM发生的核心机制，也是心肌纤维化的关键调节因子，而心肌纤维化是DCM心脏重构的重要特征。同时，大量聚集的ROS促进脂质过氧化（夺取PUAs中的氢离子），通过铁死亡途径损害心肌细胞，加速DCM的病理进展。铁死亡相关的ROS包括超氧化物（superoxide）、过氧化氢（hydrogen peroxide）和羟基自由基（hydroxyl radicals），其中羟基自由基的活性和毒性最强。核因子红系2相关因子2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2, NrF 2）作为多途径参与糖尿病细胞损伤的细胞因子，近来年被发现与DCM心肌细胞铁死亡机制相关。Wang等通过异硫氰酸盐（sulforaphane）促发腺苷酸激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase, AMPK）介导的NrF 2 激活，抑制DCM小鼠心肌细胞铁死亡信号表达，并改善心肌功能。Zhang等通过姜黄提取物使NrF 2过表达并向核内移位后可以促发氧化清除因子血红素氧合酶-1（Heme Oxygenase-1, HO-1）的表达，从而抑制DCM心肌细胞铁死亡的发生。Wu等利用姜酚（6-Gingerol）也发现了其通过Nrf2/HO-1信号通路对DCM小鼠的心肌保护作用。另外，一种钠-葡萄糖共转运蛋白2抑制剂卡格列净（canagliflozin），被临床作为降糖药物广泛使用的同时，近来也被证实可以通过铁死亡途径改善DCM病情，尽管目前的研究只停留于动物与细胞实验。

铜死亡（cuproptosis）是2022年由Tsvetkov等人发现的一种新的细胞死亡形式，由线粒体中铜的靶向聚积而触发，驱动脂化的三羧酸（Tricarboxylic acid, TCA）循环酶直接与铜结合而发生。与铁死亡类似，铜是机体中不可缺少的微量元素，但当细胞内铜离子浓度超过维持体内平衡的阈值时，就会诱发细胞毒性。多种证据表明，铜死亡的杀伤作用主要由细胞内铜的积累造成，而不是一些小分子蛋白直接聚积，他们只能通过铜离子载体与铜结合才具有杀伤性，当取消这些化合物的铜结合能力的修饰后，细胞杀伤能力的丧失。因此，主动结合并将铜转运到细胞内的铜离子载体成为铜死亡领域的重点研究对象。铜离子载体诱导的细胞死亡是一种与其他已知细胞死亡模式截然不同的机制，作为一个新发现的死亡机制，目前的相关研究甚少。FDX1是蛋白-脂酰化的上游调控因子，抑制FDX1可阻断TCA循环链，这表明FDX 1可能成为铜死亡路径上的关键因子。

目前尚没有铜死亡与DCM的相关研究报道，但心肌细胞的生理机能已经确定与铜代谢密切相关。早在20年前，研究人员就发现糖尿病患者存在铜代谢异常，糖尿病患者较之非糖尿病患者血浆及尿液中的铜离子水平升高，而心肌细胞中的铜含量则是下降的。研究表明，更赖线粒体呼吸的细胞对铜诱导剂的敏感性是主要依赖糖酵解的细胞的1000倍，因此，缺铜损害线粒体功能，导致能量降低，从而导致心肌肥大。相应地，增加血铜水平可以有效减少心肌肥厚。Zhang等发现糖尿病心衰大鼠的心肌细胞线粒体结构及功能改变导致铜稳态破坏：线粒体内主要铜酶细胞色素c氧化酶（major mitochondria-resident copper-enzymes cytochrome c oxidase, mt-Cco）和超氧化物歧化酶1 （superoxide dismutase 1, mt-Sod 1），以及三种主要的线粒体铜伴侣蛋白[ Cco铜伴侣蛋白11和17（Cco copper chaperone 11 and 17, Cox11 and Cox17），线粒体内Sod1铜伴侣蛋白（mitochondria-resident copper chaperone for Sod1, mt-Ccs）的表达均发生改变，首次揭示了心肌细胞铜转运失调可能是DCM的关键致病过程，与先前的理论一致。

作者：许红娇

审校：周宇/朱敏敏