狼疮肾炎（LN）
系统性红斑狼疮（SLE）是一种累及多系统多器官的自身免疫性疾病，好发于中青年女性。肾脏是SLE最常累及的器官之一，高达三分之二的SLE患者会在发病5年内出现狼疮肾炎（LN）临床表现，而在LN诊断后的10年内，5%~30%的患者将最终发展为终末期肾脏病。LN的核心发病机制目前尚未阐明，探索基于LN具体发病机理的靶向精准治疗，是当前风湿领域的研究重点和难点。
本研究通过单细胞分析技术，揭示了肾脏特异性的适应性免疫格局，特别是B细胞和T细胞在肾脏中的异质性、它们在局部的克隆扩增、以及它们在LN中的作用。文章近日发表于《Annals of the Rheumatic Diseases》（IF 20.3）。通讯作者为上海交通大学医学院附属仁济医院风湿科扶琼主任、中国科学院上海免疫与感染研究所张晓明研究员。共同第一作者为上海交通大学医学院附属仁济医院风湿科吴春梅主治医师、中国科学院上海免疫与感染研究所江珊、陈泽川博士。
研究方法
本研究对六名活动性LN患者的肾活检和匹配血液样本以及四名健康供体 (HD) 的血液样本进行了深入分析，并对分选纯化的B细胞和T细胞进行了单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq)/单细胞 B 细胞受体 (BCR)/TCR 测序 (scBCR/TCR-seq) 分析。此外，还运用了流式细胞术、转座酶可接近性测序（ATAC-seq）、多重免疫组化和功能研究等方法来验证转录组结果。
研究结果
1.单细胞图谱：
t分布随机邻域嵌入（t-SNE）图：展示了52,939个B细胞和T细胞的20个不同聚类，每个聚类根据特定的免疫细胞亚群和基因表达模式进行命名和颜色编码。
主成分分析（PCA）：显示了健康供体血液（BL-HD）、SLE患者血液（BL-SLE）和SLE肾脏（K-SLE）组之间的差异，揭示了适应性免疫系统在LN患者肾脏中的巨大变化。
2.肾脏中非典型B细胞（ABCs）和抗体分泌细胞（ASCs）的局部富集：
B细胞聚类t-SNE图：展示了肾脏中B细胞的异质性，并识别出与健康对照组相比，在LN患者中显著增加的特定B细胞亚群，特别是ABCs和rASCs。
B细胞聚类比例图：显示LN患者肾脏中ABCs和rASCs的比例显著高于健康供体和SLE患者外周血，表明这些细胞在LN肾脏中的积聚。
B细胞聚类比例的箱线图：进一步证实了LN患者肾脏中ABCs和rASCs的高比例，与健康供体和SLE患者外周血相比，差异显著。
多重免疫组化（mIHC）验证图：结果与单细胞测序数据一致，证实了LN患者肾脏中ABCs和ASCs的高浸润。
差异表达基因（DEGs）的热图：揭示了不同B细胞亚群中基因表达模式的差异，特别是在LN患者肾脏中的ABCs和rASCs。
信号通路富集分析：显示LN患者肾脏中的ABCs和rASCs显著富集了IFN、炎症和应激相关途径，提示这些细胞在LN发病机制中的潜在作用。
IFN相关基因（IRGs）的热图：揭示了不同B细胞亚群中IFN信号的激活情况，特别是在LN患者肾脏中的ABCs和rASCs。
转录因子调控网络分析：揭示了控制ABCs和rASCs功能的转录因子网络，特别是与I型IFN相关的转录因子。
转录因子活性的小提琴图：进一步证实了LN患者肾脏中ABCs和rASCs中特定转录因子的高活性。
转录因子调控网络图：揭示了B细胞功能中关键转录因子的调控网络，特别是在LN患者肾脏中的ABCs和rASCs。
3.LN患者肾脏内ASCs中IGHG1和IGHG3亚型的优势：
各亚型的比例环形图：显示了LN患者肾脏中ASCs的免疫球蛋白亚型比例，其中IGHG1和IGHG3亚型的比例显著高于健康供体和SLE患者外周血，表明这些亚型在肾脏中的B细胞反应中占主导地位。
BCR多样性和前20个克隆型（D20）比例图：显示LN患者肾脏中B细胞的BCR多样性降低，而前20个克隆型的比例增加，表明肾脏中B细胞的克隆扩增活跃。
各亚型中克隆扩增的堆叠柱状图：显示了LN患者肾脏中IGHG1和IGHG3亚型的ASCs中克隆扩增尤为显著。
ASCs中HCDR3（重链互补决定区3）长度的小提琴图：显示LN患者肾脏中ASCs的HCDR3长度较长，这可能意味着这些细胞具有更高的自身免疫性。
ASCs中重链和轻链体细胞突变频率的小提琴图：显示LN患者肾脏中ASCs的IGHV和IGLV基因突变频率较低，这与滤泡外B细胞反应的特征一致。
编者注：LN患者肾脏中的B细胞反应主要通过滤泡外途径介导，表现为IGHG1和IGHG3亚型的高比例、克隆扩增的增加以及体细胞突变频率的降低。这些发现为理解LN的免疫病理机制提供了重要见解。
4.肾脏中ASCs的克隆分析：
克隆扩增B细胞的网络图：展示了血特异性、肾脏特异性和血-肾共享的克隆扩增B细胞的网络关系图。识别了在LN患者肾脏中活跃的特定B细胞克隆型。
IGHV基因使用频率图：展示了不同组中IGHV基因使用的频率，特别是肾脏特异性克隆型中IGHV4-59家族的扩增，这可能与自身免疫反应有关。
肾脏特异性克隆型分析：揭示了肾脏特异性克隆型中ABCs和rASCs之间的共享IGHV4-59克隆型，表明肾脏中可能存在局部B细胞分化。
器官特异性和共享B细胞克隆型的SHM频率：比较了肾脏特异性和共享B细胞克隆型的体细胞超突变（SHM）频率，发现肾脏来源的克隆型SHM频率显著低于外周血，支持肾脏中存在活跃的局部B细胞反应。
IGHV4-59 补体决定区(CDRs)和框架区(FWRs)的SHM频率：展示了IGHV4-59克隆型在CDRs和FWRs的SHM频率，揭示了肾脏和外周血中IGHV4-59+ ASCs的多样性。
编者注：这里展示了关于LN患者肾脏中B细胞克隆型的重要信息，特别是关于克隆扩增、IGHV基因使用和SHM频率的数据，这些结果支持了肾脏中存在活跃的、可能由局部抗原驱动的滤泡外B细胞反应的观点。
5.肾脏中富集的颗粒酶K（GZMK）+ CD8 T细胞与肾脏内ABCs共享分子特征：
CD8 T细胞聚类t-SNE图：展示了基于单细胞RNA测序数据的CD8 T细胞聚类，包括不同的CD8 T细胞亚群，如naïve T cells (CD8T1-naïve), Tcm (CD8T2-Tcm), GZMK+ T cells (CD8T3-GZMK), GZMB+ T cells (CD8T4-GZMB)和proliferative T cells (CD8T5-pT)。帮助识别了在LN患者肾脏中活跃的特定CD8 T细胞亚群。
CD8 T细胞亚群比例的箱线图：展示了在健康供体、SLE患者外周血和SLE患者肾脏中不同CD8 T细胞亚群的比例。特别指出，GZMK+ CD8 T细胞（CD8T3-GZMK）在LN患者肾脏中的比例显著高于其他两组，表明这些细胞在肾脏中的富集。
GZMK+ CD8 T细胞流式细胞术分析：流式细胞术分析进一步验证了GZMK+ CD8 T细胞在LN患者肾脏中的频率显著高于外周血，进一步证实了这些细胞在肾脏中的富集。
GZMK+ CD8 T细胞频率比较：比较了LN患者肾脏和外周血中GZMK+ CD8 T细胞的频率，显示肾脏中GZMK+ CD8 T细胞的频率显著增加。
mIHC显示GZMK+ CD8 T细胞浸润：mIHC技术显示了LN患者肾脏中GZMK+ CD8 T细胞的浸润情况，与正常肾脏组织相比，显示了这些细胞在肾脏中的显著增加。
GZMK+ CD8 T细胞中DEGs的热图：展示了GZMK+ CD8 T细胞中前15个差异表达基因（DEGs）的表达值，揭示了这些细胞在LN患者肾脏中的分子特征。
GZMK+ CD8 T细胞中富集的标志性基因集途径：展示了GZMK+ CD8 T细胞中富集的标志性基因集途径，特别是I型和II型干扰素（IFN）响应途径，表明这些细胞在炎症反应中的潜在作用。
GZMK+ CD8 T细胞中转录因子调控网络分析：使用单细胞调控网络推断和聚类（SCENIC）算法，展示了GZMK+ CD8 T细胞中转录因子调控网络的活性，突出了与I型IFN相关的转录因子。
GZMK+ CD8 T细胞功能网络图：展示了GZMK+ CD8 T细胞中关键转录因子及其靶基因之间的调控关系，揭示了这些细胞在LN中的潜在功能。
编者注：这里提供了关于LN患者肾脏中GZMK+ CD8 T细胞的重要信息，特别是关于这些细胞的富集、分子特征和潜在功能的证据。
6.肾脏内GZMK+ CD8 T细胞中丰富的IFN-γ特征：
干扰素-γ（IFNG）表达水平的t-SNE图：展示了不同CD8 T细胞亚群中IFNG基因表达水平的分布情况，显示了GZMK+ CD8 T细胞中IFNG的高表达。
IFNG基因表达水平的小提琴图：展示了不同CD8 T细胞亚群中IFNG基因表达水平的分布，显示GZMK+ CD8 T细胞表达更高水平的IFNG。
IFNG表达的RNAscope和mIHC分析：比较了LN患者肾脏活检样本中GZMK+和GZMK- CD8 T细胞中IFNG+细胞的频率，显示GZMK+ CD8 T细胞中IFNG+细胞的比例更高。
ATAC-seq分析IFNG、IL21和GZMK的染色质可及性：通过Assay for Transposase Accessible Sequencing (ATAC-seq)分析，展示了GZMK+ CD8 T细胞中IFNG、IL21和GZMK基因位点的染色质可及性，表明这些基因在GZMK+ CD8 T细胞中更可能被激活和表达。
编者注：这里展示了LN患者肾脏中GZMK+ CD8 T细胞中IFN-γ表达特征的重要信息，特别是这些细胞中IFNG基因的高表达和染色质可及性，揭示了这些细胞在肾脏炎症反应中的潜在作用。
7.肾脏内GZMK+ CD8 T细胞中丰富的IFN-γ特征：
细胞间通讯分析图：展示了GZMK+ CD8 T细胞和ABCs之间的细胞间通讯，特别是通过II型IFN信号通路的相互作用。
配体-受体相互作用分析图：展示了ABCs和不同T细胞亚群之间的配体-受体相互作用，突出了GZMK+ CD8 T细胞和ABCs之间的强烈相互作用，特别是IFN-γ和其受体之间的相互作用。
GZMK+ CD8 T细胞对ABCs分化的影响：通过流式细胞术分析，展示了健康供体外周血B细胞与LN患者CCR5+ (GZMK+) 或CCR5− (GZMK−) CD8 T细胞共培养后，T-bet+ ABCs的生成频率。
GZMK+ CD8 T细胞促进ABCs分化的累积数据：展示了与GZMK+ CD8 T细胞共培养的健康供体外周血B细胞中T-bet+ ABCs生成频率的统计数据，显示GZMK+ CD8 T细胞比GZMK− CD8 T细胞更有效地促进ABCs的分化。
共培养上清液中细胞因子浓度比较：比较了与CCR5+ (GZMK+) 或CCR5− (GZMK−) CD8 T细胞共培养的健康供体外周血B细胞上清液中IFN-γ、IL-6、IL-17和IL-21的浓度，显示与GZMK+ CD8 T细胞共培养的上清液中这些细胞因子的浓度显著更高。
中和IFN-γ对ABCs分化的影响：展示了使用中和IFN-γ抗体处理后，与GZMK+ CD8 T细胞共培养的健康供体外周血B细胞中T-bet+ ABCs生成频率的变化，显示中和IFN-γ可以减少ABCs的生成。
阻断IL-21对ABCs分化的影响：展示了使用可溶性IL-21受体蛋白阻断IL-21后，与GZMK+ CD8 T细胞共培养的健康供体外周血B细胞中T-bet+ ABCs生成频率的变化，显示阻断IL-21也可以减少ABCs的生成。
肾脏中三级淋巴结构（TLS）的mIHC分析：通过多重免疫组化技术，展示了LN患者肾脏中三级淋巴结构（TLS）的分布和组成，特别是ABCs和GZMK+ CD8 T细胞在TLS中的共定位。
ABCs和GZMK+ CD8 T细胞密度的相关性：展示了LN患者肾脏中ABCs和GZMK+ CD8 T细胞密度之间的正相关性，表明这两种细胞类型在肾脏中的分布和丰度密切相关。
ABCs和GZMK+ CD8 T细胞与LN治疗反应的相关性：比较了LN患者肾脏中ABCs和GZMK+ CD8 T细胞的初始浸润率与患者对治疗的反应之间的关系，显示高浸润率与治疗无反应相关。
编者注：这里提供了关于LN患者肾脏中GZMK+ CD8 T细胞和ABCs相互作用及其在疾病中作用的重要信息，特别是GZMK+ CD8 T细胞通过IFN-γ和IL-21促进ABCs分化的能力，以及这两种细胞类型在肾脏炎症和治疗反应中的潜在作用。
总结
本研究通过单细胞多组学技术，揭示了LN肾脏中滤泡外B细胞应答的特征，发现GZMK+ CD8 T细胞可能是参与LN致病的核心T细胞亚群，并通过与ABCs互作形成狼疮肾脏致病性免疫微环境。总之，这些发现不仅揭示了LN肾脏中的致病性免疫微环境，也为LN的创新治疗提供了潜在的靶点。
参考文献
Wu,C.,Jiang,S.,Chen,Z.et al.Single-cell transcriptomics reveal potent extrafollicular B cell response linked with granzyme K+ CD8 T cell activation in lupus kidney.Annals of the Rheumatic Diseases.2024.doi:10.1136/ard-2024-225876.
来源：Immu-Express
