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高角膜透性封装环孢素A的活性氧响应纳米制剂用于干眼治疗
Highly effective corneal permeability of reactive oxygen species-responsive nano-formulation encapsulated cyclosporine a for dry eye management
Dejun Yang, Yi Han, Yili Wang, Yingying Pan, Lan Zhen, Zuguo Liu, Cheng Li*, Yunlong Wu*, Huaqiong Li*
温州医科大学附属第一医院
干眼病(DED)已成为全球公认的公共健康问题，世界上约有三分之一的人口患有这种疾病。干眼被定义为一种多因素疾病，其特征是泪膜稳定性的内稳态丧失，伴有各种眼部症状干眼的病因复杂，其发病机制尚未完全清楚。最近的研究表明，氧化应激刺激及其引起的炎症是干眼发生和进展的主要原因。紫外线辐射、空气污染物和其他应激源会引发活性氧(ROS)的过度积累，导致脂质过氧化、氧化DNA损伤和炎症细胞因子的积累。ROS的过度表达最终会导致炎症。温州医科大学附属第一医院李花琼教授在国际知名学术期刊Chemical Engineering Journal（IF=13.1）上发表了题为“Highly effective corneal permeability of reactive oxygen species-responsive nano-formulation encapsulated cyclosporine a for dry eye management”的研究论文。该研究证实了该抗氧化纳米载体用于改善CSA的眼表给药，并被认为对DED的治疗具有协同作用。干眼病(DED)已成为全球公认的发病机制复杂的公共卫生问题。研究表明氧化应激损伤及其诱导的炎症反应是干眼发生发展的主要因素。本文报道了一种新的抗氧化和活性氧(ROS)响应胶束系统，以改善高疏水性免疫抑制剂环孢素A (CSA)的眼表递送，该药物载体与负载的抗炎药物一起使用以实现DED的联合治疗。其中，硒取代的无规共聚物Se-PEG-PPG是这种设计的关键，它自组装成具有中性外壳和小尺寸（<50nm）的穿透角膜的纳米级胶束。由于具有清除ROS的硒醚基团，Se-PEG-PPG胶束还通过降低细胞内氧化应激和抑制细胞凋亡发挥协同治疗作用。最后，在小鼠干眼模型中证明了CSA@Se-PEG-PPG滴眼液的抗氧化、抗炎和治疗作用。总之，这种多功能给药系统为DED和各种ROS眼部相关疾病的治疗提供了一种很有前景的方法。干眼症是一种多因素疾病，其特征是泪膜稳定性的稳态丧失，并伴有各种眼部症状。干眼症的病因复杂，发病机制尚不完全清楚，研究表明氧化应激刺激及其诱导的炎症反应是干眼症发生发展的主要因素。紫外线辐射、空气污染物和其他应激源会引发活性氧（ROS）的过度积累，导致脂质过氧化、DNA氧化损伤和炎症细胞因子的积累增加。ROS的过度表达最终导致眼表炎症和泪腺损伤，促进干眼的病理发展。在此基础上，探讨了抗氧化剂的潜在应用前景。据报道，含有抗氧化剂的滴眼液，如维生素A、visomittin（线粒体抗氧化剂）、硒蛋白P、槲皮素和没食子酸衍生物可有效保护眼表免受氧化应激。消除过量产生的ROS为DED治疗提供了一种新的方法。Se-PEG-PPG胶束的抗氧化和ROS响应能力
作者采用ABTS法测定聚合物的总抗氧化能力。在氧化剂存在的情况下，ABTS可氧化为绿色ABTS⋅+，加入抗氧化剂后氧化反应受到抑制。通过测定ABTS⋅+的吸光度可以确定聚合物的总抗氧化能力。与F127相比，在相同浓度下，含硒醚段的Se-PEG- PPG的总抗氧化能力显著提高（图1E），抗氧化能力随Se-PEG-PPG浓度的增加呈线性增加。
在证实了Se-PEG-PPG聚合物的抗氧化性后，作者进一步检测了Se-PEG-PPG胶束的ROS响应能力。50μM和500μM H2O2溶液用于模拟ROS过度聚集的干眼微环境。与ROS共孵育后，在CSA@Se-PEG-PPG胶束溶液中观察到沉淀，表明被封装的CSA从胶束中释放出来。DLS的结果显示了CSA@Se- PEG-PPG胶束在不同浓度过氧化氢溶液中的胶束大小和多分散性的变化（图1F）。孵育半小时后，PDI显著升高; 50 μM H2O2处理后的胶束尺寸由47.35±0.50 nm增加到142.2±30.65 nm; 在500 μM H2O2组中，平均尺寸增加到442 nm。这些结果表明，胶束的载药能力下降，胶束结构被破坏。此外，荧光素二乙酸酯（FDA）被用作模型疏水药物，以模拟载药胶束中ROS响应性药物的释放。由于荧光猝灭效应，包埋在胶束中的FDA的荧光弱于游离的FDA。如图1G所示，荧光随着FDA的释放而增加。在50 μM H2O2孵育后，荧光在8小时达到最大值，说明大部分FDA在8 h内迅速从FDA@Se-PEG-PPG胶束中释放出来。相比之下，含有FDA@Se-PEG-PPG胶束的PBS溶液即使在12 h后也表现出较低的荧光强度。上述结果表明硒醚片段是赋予Se-PEG-PPG抗氧化能力的关键因素。用H2O2处理后，疏水性硒醚被氧化为亲水性硒氧化物或硒酮，导致胶束核中疏水相互作用的减少。当CSA@Se-PEG-PPG胶束保持在一个富含ROS的环境中，可以观察到胶束的尺寸增加，胶束结构破坏和疏水性药物释放。同时，硒醚还具有抗氧化剂的作用，因为在氧化还原反应中消耗了ROS。图2.
(A)不同浓度Se-PEG-PPG胶束处理HCEC细胞24 h后的细胞活力；不同浓度CSA (B)和CSA@Se-PEG-PPG (C)处理HCEC细胞24 h后的细胞活力。(D)用FDA@Se-PEG-PPG和游离FDA处理HCEC细胞1 h和2 h后的细胞摄取情况。
体外细胞相容性和摄取效率
在将CSA@Se-PEG-PPG胶束应用于体外和体内实验之前，通过CCK-8法进行细胞毒性测试。即使胶束浓度达到1000 μg/mL, Se-PEG-PPG胶束对人角膜上皮细胞(HCECs)也没有明显的细胞毒性(图2A)。作者进一步研究了CSA和CSA@Se-PEG-PPG胶束在HCEC中的细胞毒性，当CSA浓度<4 μg/mL时，未观察到明显的细胞毒性（图2B和2C）。以疏水染料FDA为模型药物来跟踪HCE细胞对胶束的摄取效率。FDA@Se-PEG-PPG胶束和相同浓度的游离FDA分别与HCEC细胞共培养，用共聚焦显微镜检测细胞内荧光强度。随着共培养时间的延长，HCEC细胞的荧光强度增加（图2D），同时，FDA@Se-PEG-PPG组的荧光强度显著高于游离FDA组，说明Se-PEG-PPG胶束增强了疏水药物的细胞摄取效率。图3.
(A)以H2O2组为阳性对照，DCFH-DA检测HCEC细胞中ROS水平。(B)以H2O2组为阳性对照，用DCFH-DA荧光强度评价HCEC细胞中的ROS水平。 (C) 50 μM H2O2和不同浓度Se-PEG-PPG胶束处理HCEC细胞24 h后的细胞活力，与阳性对照H2O2组比较。
细胞内氧化应激水平与细胞凋亡
为了验证Se-PEG-PPG胶束降低细胞内氧化应激的效率，采用DCFH-DA评价细胞内ROS水平。HCECs在含有50 μM H2O2的培养基中培养，以模拟体外ROS过度表达的炎症角膜微环境，同时分别用CSA、Se-PEG-PPG、CSA@Se-PEG-PPG、F127和CSA@F127胶束处理，与HCECs 37℃ 孵育2 h后，在激光扫描共聚焦显微镜下观察DCFH-DA细胞内荧光，并定量荧光强度。使用不含抗氧化剂片段的F127来验证硒化物在调节细胞内ROS水平中的作用。H2O2处理组DCFH-DA的荧光强度显著高于对照组（图3A和3B），说明50 μM H2O2处理显著提高了HCECs细胞内ROS水平。与H2O2组相比，F127胶束组的荧光强度没有明显变化。值得注意的是，仅用Se-PEG-PPG胶束处理可有效降低ROS水平， CSA@Se-PEG-PPG胶束处理效果最好。作者进一步探讨了Se-PEG-PPG胶束对细胞损伤的抑制作用。通过用50 μM过氧化氢孵育HCECs 24h来诱导体外氧化应激损伤模型，同时用不同浓度的Se-PEG-PPG胶束处理HCECs。50 μM H2O2处理24 h后，细胞活力降至18%，Se-PEG-PPG胶束处理以浓度依赖性方式减轻了HCECs的氧化应激损伤（图3C）。这些结果提示Se-PEG-PPG胶束在降低细胞内氧化应激和抑制细胞损伤方面具有协同作用。(A)使用新鲜切除兔角膜的Franz扩散细胞;(B)商用CSA滴眼液、CSA@Se-PEG- PPG、CSA@F127胶束的体外经角膜渗透谱;(C)Dir和Dir@Se-PEG-PPG与兔眼孵育2小时后的共聚焦荧光图像。箭头指示Dir扩散到角膜基质和内皮。体外和体内角膜渗透
为了进一步将Se-PEG-PPG胶束应用于眼表给药，作者使用新鲜切除的兔角膜在Franz扩散细胞中进行了Se-PEG-PPG胶束的离体角膜渗透研究(图4A)。分子量与CSA相似的疏水性染料Dir用于跟踪药物在切除的角膜中的释放、扩散和渗透（图4C），在2h内，游离Dir仅停留在角膜上皮表面，Dir@Se-PEG- PPG组Di在角膜上皮各层均可见，并向角膜基质和内皮扩散。作者进一步研究了CSA@Se-PEG-PPG胶束、CSA@F127胶束和市面上的滴眼液CSA的释放和渗透。通过角膜的CSA在受体室中均被回收并使用HPLC检测。与CSA@F127胶束和市售CSA滴眼液相比，CSA@Se-PEG-PPG胶束穿透角膜的倾向较高（图4B）。CSA在眼表各层的积聚，可能调节潜伏在角膜或结膜上皮下的免疫细胞。(A)干眼模型建立方案及治疗策略;(B)不同处理眼表OGD染色的代表性照片; (C)不同处理的酚红线泪液分泌量的图像，红色箭头指示泪液分泌的位置; (D、E)各组角膜OGD染色强度及泪量定量分析。纳米制剂滴眼液治疗干眼症的体内临床评价
为进一步探讨高角膜通透性纳米制剂滴眼液对干眼的临床治疗效果，采用干燥应激法建立小鼠干眼模型，然后小鼠每天接受两次滴眼液(F127, Se-PEG-PPG, CSA, CSA@F127, CSA@Se-PEG-PPG)给药，直到7天治疗周期结束时处死(图5A)。考虑到角膜上皮缺损是干眼的典型特征，对角膜上皮进行OGD染色，外层损伤的深上皮区域显示为绿色。如图5B所示，阳性对照组(DS组)，F127治疗组，荧光素染色明显，干眼症状较重， Se-PEG-PPG、CSA、CSA@F127治疗可轻微减轻角膜上皮损伤，而CSA@Se-PEG-PPG显示出比其他制剂更好的治疗效果 (图5D)。泪液生成是评估干眼发展的另一个临床指标，由于泪液保护眼表不直接暴露在复杂多变的环境中，因此泪液缺乏或蒸发会导致角膜上皮损伤，从而加重干眼症状。苯酚红棉线试验代表了泪腺分泌功能，结果表明，干燥应激(DS7组)可显著减少泪液的产生， F127滴眼液几乎没有恢复泪液体积，而Se-PEG-PPG、CSA、CSA@F127制剂则能在一定程度上促进泪液分泌。与其他组相比，局部应用CSA@Se-PEG-PPG可提高泪液产生，这意味着这种眼部输送系统具有更有效的干眼治疗效果(图5C和5E)。图6. 纳米制剂通过保护结膜杯状细胞，减少眼表细胞凋亡来缓解干眼症
(A)不同方法处理后PAS染色的代表性照片，黑色矩形为穹窿结膜杯状细胞。(B)角膜和结膜的TUNEL染色图像。结膜杯状细胞(C)、角膜上皮TUNEL阳性细胞(D)和结膜(E)的定量统计。
干眼症是一种慢性炎症性疾病，具有明显的氧化应激，Se-PEG-PPG纳米胶束具有较高的抗氧化能力，当其用于输送抗免疫药物时，可实现抗氧化和抗炎双靶点治疗，有效治疗干眼症。分布于结膜穹窿部的杯状细胞在角膜上皮上分泌粘蛋白，形成泪液膜的一部分，阻止泪液蒸发，而眼表面的炎症扩散到结膜导致杯状细胞的流失。目前，环孢素、他克莫司等抗炎药物已被证实对杯状细胞具有保护作用，对干眼的发展有阻滞作用。与正常对照小鼠相比，干燥应激(DS7组)导致杯状细胞大量丢失（图6A），使用F127滴眼液并没有逆转细胞流失的趋势，同时杯状细胞形态变小、萎缩，这种形态变化可能影响细胞的分泌功能。Se-PEG-PPG、CSA、CSA@F127和CSA@Se- PEG-PPG滴眼液显示出恢复杯状细胞数量的能力。在干燥应激下，CSA@Se-PEG-PPG滴眼液比CSA@F127滴眼液更有效地挽救了杯状细胞的损失。令人惊讶的是，Se-PEG-PPG(抗氧化)滴眼液也显示出一定的保护杯状细胞免受干燥应激损伤的效果(图6C)。综上所述， Se- PEG-PPG包封环孢素可用于更好地治疗干眼症，由于其具有高效角膜渗透性，增加了药物在角膜中的浓度以及针对干眼症病理的抗氧化和抗炎作用。(A)角膜组织MMP3、3-NT和NOX-4免疫荧光染色切片。定量分析MMP-3 (B)、NOX-4 (C)和3-NT (D)荧光强度。(E和F)角膜3-NT、NOX-4和MMP-3蛋白水平，β-actin作为对照。Western blot定量分析3-NT (G)、NOX-4 (H)、MMP-3 (I)强度。干燥应激可导致包括角膜上皮和结膜在内的眼表细胞凋亡水平升高。TUNEL阳性是指细胞凋亡的结果，与正常对照组相比，干燥应激(DS7组)明显增加了角膜上皮和结膜中TUNEL阳性细胞的数量(图6B)。F127滴眼液不能挽救细胞凋亡，但Se-PEG-PPG、CSA、CSA@F127和CSA@Se-PEG-PPG滴眼液似乎可以减轻细胞凋亡水平(图6D和6E)。考虑到Se-PEG-PPG和CSA@Se-PEG-PPG滴眼液显示出更好的抑制细胞凋亡的能力，这可能是因为抗炎治疗通常需要更长的时间才能起作用。干眼发展时MMP-3的表达增加，MMP-3通过破坏角膜上皮细胞的紧密连接破坏角膜上皮屏障。因此，当干眼发生时，根据DS7组(干燥应激小鼠)的免疫荧光结果可知MMP-3在角膜上皮中积累，Se-PEG-PPG、CSA、CSA@F127和CSA@Se-PEG-PPG组的MMP-3水平低于DS7和F127组，表明这些滴眼液可能通过抑制MMP-3来保持角膜上皮屏障功能，与其他组相比，CSA@Se-PEG-PPG滴眼液效果更好(图7A和7B)。经western blot进一步验证，与前期研究结果一致(图7F)，差异有统计学意义(图7I)。氧化应激已被证明是干眼症的关键风险因素，ROS的过量产生会引发炎症并诱导眼表损伤。在干眼症的治疗过程中，调节眼表氧化平衡是至关重要的。在DS7组中，被称为角膜上皮ROS生成酶的NOX4和3-NT增加(图7A、图7C和图7D)，当局部给药CSA@Se-PEG-PPG时，NOX4、3-NT均减少，在各治疗组间疗效最佳。western blot证实了类似的趋势(图7E、7F、7G和7H)。如前所述，CSA@Se-PEG-PPG纳米制剂在控制氧化应激方面具有高效的抗氧化和抗炎作用。综上所述，CSA@Se-PEG-PPG在治疗干眼时显示出控制ROS生成和角膜上皮损伤的强大能力。得益于这种策略，这可能是适合干眼症发病机制的良好解决方案的一个特点。
本文报道了一种基于硒取代的无规共聚物Se-PEG-PPG胶束的眼表给药。为了提高CSA的角膜通透性和生物利用度，中性壳和尺寸控制是设计和合成Se-PEG-PPG胶束的两个重要因素。本文还证明了硒醚基团在胶束抗氧化和ROS响应特性中不可或缺的作用。Se-PEG-PPG胶束降低了细胞内氧化应激，提高了CSA在抑制角膜上皮损伤、保护杯状细胞和促进泪液分泌方面治疗干眼的效果。结果表明，该纳米载体在眼表疾病治疗中具有很好的应用前景。该工作提供了一种用于治疗眼表疾病的多功能药物递送系统。转载自：Ocular Biomaterial Team
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