引言：为了探索MYRF突变对睫状小带的结构及其主要分子组成的影响，中山大学葛坚教授团队发表了题为“Nanophthalmos-Associated MYRF Gene Mutation Causes Ciliary Zonule Defects in Mice”的研究论文，该论文已被在国际知名医学期刊Investigative Ophthalmology and Visual Science接收并作为当期封面文章发表。
小眼球症（Nanophthalmos）是一种比较罕见的先天性疾病，常以眼轴短、角膜直径小、前房浅等为特征。此病患者常伴有继发性闭角型青光眼、睫状小带缺陷等并发症，手术风险较高。睫状小带由原纤维蛋白微纤维束组成，在将眼晶状体固定在睫状体上起着重要作用。目前，对小眼球症相关基因突变导致前房浅和睫状小带缺陷的分子机制尚不清楚。
利用CRISPR/Cas9系统构建MYRF基因突变小鼠模型并通过PCR和Sanger测序分析小鼠基因型。
图1
图1主要展示了利用CRISPR/Cas9 基因编辑系统生成MYRF mut/+小鼠的过程，构建好的MYRF基因突变小鼠模型用于后续研究。
分别通过HE染色测量小鼠眼轴长度和前房深度，通过银染观察睫状小带的结构和纤维密度，通过免疫组化检测MYRF、FBN1和FBN2的表达水平。
通过qRT-PCR、Western blot分别检测睫状体中MYRF、FBN1和FBN2的mRNA表达水平和蛋白表达水平。
使用Student’s t-test或Mann-Whitney U-test进行两组实验数据的比较。使用SPSS 20.0软件和GraphPad Prism 6软件进行统计分析。
图2
图3
图4
图2是对小鼠进行的眼球免疫组织化学分析，以此确定MYRF基因的表达模式。从图中可以看出，MYRF基因在睫状体和视网膜中的表达水平相对较高，尤其是在RPE、内核层 (INL) 和神经节细胞层 (GCL)。
如图3、4，为量化MYRF mut/+小鼠睫状体中MYRF基因的转录和蛋白质表达水平，对睫状体进行了定量实时 PCR 和蛋白质印迹分析。分析结果表明，MYRF mut/+小鼠睫状体中MYRFmRNA 的表达以及蛋白质表达均显著减少。另外，FBN1和FBN2 的mRNA 的表达以及蛋白质表达亦显著减少，这暗示MYRF mut/+突变体中 NPCE 产生的原纤维蛋白减少了，与小带缺陷的表型一致。
图5
如图5，为了研究MYRF突变对小鼠眼前节的影响，采用 HE 染色测量六只同窝对照小鼠 ( MYRF +/+ ) 和六只突变小鼠 ( MYRF mut/+ )的 ACD和AL，与对照组相比，MYRF mut/+小鼠的 ACD 显著降低，简单拥挤值显著更高（P＜0.001），平均ACD/AL则更低（P＜0.01），说明MYRF基因突变会导致小鼠前房深度变浅。
图6
如图6，本实验首次测试并采用银染色策略来探索睫状小带的精细结构。银染后，将图中带星号的几条小带纤维定义为主要悬韧带纤维以量化其变化。结果发现主要悬韧带纤维的平均数量显著减少（P < 0.05)，表明在小眼球症相关的MYRF突变体中发生了睫状小带的结构缺陷。另外，MYRF mut/ +小鼠从睫状上皮延伸到晶状体赤道处的睫状纤维密度也有所降低。
由于FBN1和FBN2是睫状小带中原纤维蛋白微纤维的最重要分子标记，实验用相应的抗体对眼部样本进行染色来判断FBN1和FBN2情况。免疫荧光分析显示，与MYRF +/+睫状小带相比， MYRF mut/+睫状小带中的主要FBN1染色和FBN2染色纤维均减少（P <0.01），这与银染色的结果一致。
通过构建小鼠模型，研究者验证MYRF基因在小眼球症的发生发展中起着重要作用，其突变可能导致小鼠睫状小带结构缺陷，还与前房浅和继发性闭角型青光眼等并发症有关。更重要的是，本实验首次利用银染方法对睫状小带的结构进行研究，这可能对未来睫状小带的研究提供思路。另外研究结果也在临床上具有很大意义，它提示眼科医生在白内障手术或抗青光眼手术中应注意对小眼球症患者进行术前睫状小带评估，以避免引发严重的并发症。
信 源
Yu X, Sun N, Yang X, et al. Nanophthalmos-Associated MYRF Gene Mutation Causes Ciliary Zonule Defects in Mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2021;62(3):1. doi:10.1167/iovs.62.3.1
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