青光眼是一种以进行性视网膜神经节细胞（RGC）缺失和视野缺损为特征的常见神经退行性疾病。然而，对调控RGC损伤与死亡的确切途径仍然知之甚少。为此，着眼于ERK 1/2-Drp 1-活性氧（ROS）轴在RGC死亡中的作用，以及Drp 1介导的线粒体功能障碍与病理性高眼压（ph-IOP）损伤中的泛凋亡之间的关系进行研究。中南大学湘雅医院夏晓波教授团队于国际知名杂志Redox Biology（IF=10.7）上发表了题为“Pathologically high intraocular pressure induces mitochondrial dysfunction through Drp1 and leads to retinal ganglion cell PANoptosis in glaucoma”的研究成果。
青光眼是一种常见的神经退行性疾病，其特征是视网膜神经节细胞（RGCs）的进行性丧失和视野缺陷。病理性高眼压（ph-IOP）是青光眼发生和进展的重要风险因素之一，能够引发视网膜的氧化应激、炎症、缺血再灌注损伤等病理变化，最终导致RGCs的退化和死亡。然而，目前的治疗策略如药物与手术降眼压等并不能完全阻止青光眼的进展或RGCs的损伤。因此，研究其他可能的致病因素对优化青光眼的治疗策略至关重要。
在青光眼的病理机制中，线粒体功能障碍起着关键作用。动力蛋白1（Drp1）是一种在线粒体分裂过程中起关键作用的蛋白，其通过多种翻译后修饰参与调控线粒体形态。Drp1在青光眼病理中的作用已被多项研究所证实，但其在不同青光眼模型中可能发挥不同的作用，且在ph-IOP作为青光眼主要风险因素的病理中的作用研究尚不充分。
研究首先通过体外的R28视网膜细胞系建立氧糖剥夺/再灌注（OGD/R）模型模拟ph-IOP诱导的损伤，并在C57BL/6J小鼠上复制ph-IOP模型以模拟青光眼的病理状态。通过药物干预实验，研究了Drp1抑制剂Mdivi-1、p-ERK1/2抑制剂PD98059和ROS抑制剂Mito-TEMPO对RGCs损伤的保护作用。研究中使用了Hoechst 33342/PI双重染色、Mito-SOX Red染色和HE染色等多种方法来评估细胞死亡和组织损伤、检测线粒体膜电位和ROS产生与评估Drp1及其磷酸化形式的表达，同时观察线粒体形态变化与评估线粒体能量代谢状态。研究还运用siRNA技术与RNA测序分析等探究Drp1与ERK1/2在细胞损伤中的作用并解析分子机制。此外，研究还包括了对高眼压青光眼患者和正常眼压白内障患者的临床样本分析，以验证实验结果的临床相关性。
1.OGD/R模型诱导的细胞损伤：
研究中，通过氧糖剥夺/再灌注（OGD/R）模型成功模拟了病理性高眼压对R28细胞的影响，导致细胞经历了显著的线粒体功能障碍和细胞死亡。Hoechst 33342和PI双重染色检测显示，OGD/R处理后，PI阳性细胞比例显著上升，表明细胞膜出现破损。JC-1染色结果显示线粒体膜电位下降，而Mito-SOX Red染色检测到活性氧（ROS）水平显著增加，反映了线粒体功能障碍。
图1 OGD/R模型诱导R28细胞线粒体损伤和死亡
2.Mdivi-1和Drp1 siRNA对细胞损伤的保护作用：
实验进一步应用Drp1抑制剂Mdivi-1或Drp1 siRNA来评估对OGD/R诱导损伤的保护效果。结果显示，Mdivi-1和Drp1 siRNA均能有效减少细胞死亡，通过JC-1染色观察到线粒体膜电位得到部分恢复，免疫荧光分析也证实线粒体形态由碎片化转变为更完整的状态。同时，Mito-SOX Red染色显示ROS产生减少。这证明Drp1抑制剂对细胞损伤有明显保护作用。
图2 Mdivi-1处理或siRNA沉默Drp1表达均能减轻OGD/R诱导的R28细胞损伤
3.ERK1/2介导的Drp1磷酸化对线粒体动力学的调控：
研究中还使用p-ERK1/2抑制剂PD98059或ERK1/2 siRNA来探究ERK1/2-Drp1信号通路在OGD/R诱导的线粒体损伤中的作用。WB结果显示，PD98059或siRNA处理显著降低了p-Drp1 (Ser616)的水平，减少了线粒体碎片化和ROS产生，从而减轻了细胞损伤，揭示了ERK1/2-Drp1信号通路在调控线粒体动力学中的关键作用。
图3 PD 98059处理或通过siRNA沉默ERK 1/2表达减轻了OGDR诱导的对R28细胞的损伤
4.ph-IOP诱导的RGCs线粒体损伤和细胞死亡：
在小鼠ph-IOP模型中，病理性高眼压诱导的损伤导致RGCs出现线粒体功能障碍和细胞死亡。HE染色和TUNEL染色结果显示，与对照组相比，ph-IOP组的视网膜结构紊乱，RGCs数量显著减少，TUNEL阳性细胞数量增加，表明细胞凋亡率上升。
图4 ph-IOP损伤诱导的RGCs线粒体损伤和细胞死亡
5.ph-IOP损伤激活的ERK1/2-Drp1-ROS信号通路：
进一步的WB和免疫荧光分析显示，ph-IOP损伤后，视网膜中p-ERK1/2和p-Drp1(Ser616)的表达水平显著上升，表明ERK1/2-Drp1-ROS信号通路在RGCs损伤中被激活，并导致ROS的产生。这为后续研究提供了潜在的干预靶点。
图5 ph-IOP模型激活ERK-Drp1-ROS信号通路
6.抑制ERK1/2-Drp1-ROS信号通路减轻RGCs损伤：
进一步，研究通过PD98059、Mdivi-1和Mito-TEMPO对小鼠进行药物治疗，结果显示这些干预措施能显著减轻ph-IOP诱导的RGCs损伤。HE染色显示视网膜形态得到改善，TUNEL染色显示细胞凋亡减少，表明抑制ERK1/2-Drp1-ROS信号通路对RGCs具有保护作用。
图6 抑制ERK 1/2-Drp 1-ROS信号通路可减轻ph-IOP诱导的RGC损伤
7.体内抑制Drp1对RGC 泛凋亡的保护作用：
在小鼠模型中，通过siRNA或Mdivi-1抑制Drp1的表达，显著减轻了ph-IOP诱导的RGC泛凋亡。WB结果显示，与凋亡、焦亡和坏死相关的蛋白表达水平降低，证实了Drp1在调控泛凋亡中的关键作用，并揭示了其作为治疗靶点的潜力。
图7 通过siRNA或Mdivi-1处理沉默Drp1表达在体内挽救了ph-IOP诱导的RGC泛凋亡
图8 通过siRNA或Mdivi-1处理沉默Drp1表达在体内挽救了ph-IOP诱导的RGC泛凋亡
8.ERK1/2-Drp1信号通路在高眼压患者中的激活：
研究还进行了高眼压青光眼患者的临床样本分析，发现p-ERK1/2和p-Drp1(Ser616)在患者样本中的表达水平显著上升。这一发现提示ERK1/2-Drp1信号通路可能在青光眼的病理过程中发挥作用，为未来针对该通路的治疗策略提供了理论依据。
本研究深入探讨了病理性高眼压（ph-IOP）对视网膜神经节细胞（RGCs）的损伤机制，以及通过干预特定信号通路减轻这种损伤的可能性。研究发现可以有效模拟ph-IOP诱导细胞损伤的OGD/R模型，并使用Drp1抑制剂Mdivi-1与Drp1 siRNA显著减少细胞死亡并恢复线粒体功能。此外，研究也为保护RGCs提供了两条潜在的信ERK1/2-Drp1与ERK1/2-Drp1-ROS信号通路，并在临床样本中验证。这些发现共同揭示了通过调节线粒体来辅助RGCs存活的潜在治疗方向。
参考文献
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