引言：角膜内皮细胞（CECs）在体内不可再生，角膜移植是角膜内皮严重损伤的唯一治疗方法，但由于角膜供体短缺，细胞替代治疗展现出极高的临床应用前景。基于此背景，北京同仁医院金子兵教授团队报道了利用小分子诱导重编程，在体外将小鼠成纤维细胞转分化为神经嵴细胞（ciNCCs）和功能性角膜内皮细胞（ciCECs）。该题为“Conversion of mouse embryonic fibroblast into neural crest cells and functional corneal endothelia by defined small molecules”的研究成果已于国际知名学术期刊Science Advances上发表，温州医科大学的潘少辉医生是本文的第一作者。
利用模型鼠Wnt-Cre/ROSA26tdTomato，通过荧光激活细胞分选（FACS）技术，从胚胎期13.5天小鼠中提取不含NCC的成纤维细胞（MEF）。从靶向NCC谱系特异性信号转导分子中，筛选出16个候选分子，通过预实验选定6种小分子，配制成M6重编程培养液。将收集的ciNCCs连续传代，ciNCCs在形态上趋于均匀的六边形且表达多种NCC标志物，并具有向黑色素细胞、周围神经系统谱系和间充质谱系分化的能力。该步骤获得的ciNCCs在形态、基因表达和分化能力上都具备典型的NCC特征。
图1 通过小分子诱导将MEFs转化为ciNCCs。A. 重编程过程示意图；B-C. 小分子的不同组合对ciNCCs的诱导分化效率；D. 将MEFs转分化为ciNCCs过程示意图；E. 使用M6培养液将MEFs转分化为Wnt1+ ciNCCs；F. 诱导第12天后的转分化效率可达3.97%；G. ciNCCs诱导过程中的形态变化；H. 诱导过程中不同时间点的转分化效率
图2 M6诱导ciNCCs的特征。A. P3 ciNCCs保留了典型的NCC形态特征；B. ciNCCs表达多种NCC标志物；C-E. 分别为ciNCCs向黑色素细胞、施旺细胞、间充质谱系（脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞）进一步分化
选择小分子SB431542和CKI-7促进ciNCCs向ciCECs分化，研究发现小分子诱导的ciCECs具有强大的增殖能力、表达CEC特异性标记，具备CEC样功能、具备和CEC相似的基因表达模式，且电镜发现ciCECs之间存在细胞紧密连接。通过监测NCC和CEC标记，发现在诱导过程中，CEC特征基因显著上调，而MEF特征基因则显著下调。之后，本研究通过遗传谱系追踪策略证实ciNCCs和ciCECs确实来源于重编程后的MEFs，并且未经历重编程诱导的多能干细胞（iPSCs）阶段。诱导形成的ciCECs具备体外长期扩增能力。
图3 小分子诱导MEFs转分化为ciCECs。A. 小分子两步诱导法示意图；B. 初始MEFs、ciNCC集落和ciCECs集落的明场图；C. ciNCCs诱导分化为ciCECs过程中的形态变化；D. ciCECs表达CEC特异性标记；E. ciCECs与CECs都具备LDL摄取功能；F. 诱导过程中不同时间点样本的差异基因表达热图；G. 透射电镜显示ciCECs之间的细胞紧密连接
前房注射人原代CECs联合ROCK抑制剂（Y-27632）可以挽回角膜内皮功能。本研究将ciCECs联合Y-27632移植到被机械刮除角膜内皮的大泡性角膜病变兔模型中，与未治疗组（前房注射PBS）对比，移植组角膜水肿减轻，并能逐渐逆转角膜透明度。随后，研究团队证实，移植术后28天，移植的ciCEC以单层多边形的角膜内皮细胞形态紧密整合于角膜组织，提示ciCECs在角膜后表面再生和自组织，并具备角膜内皮功能。
图4 体内移植ciCECs。A. 在兔模型造模及注射ciCEC联合ROCK抑制剂的示意图；B. 移植组角膜透明度明显改善，可透见虹膜和瞳孔，而对照组的角膜混浊和间质水肿仍然严重；C. 裂隙灯显微图像显示，移植组角膜的透明度明显改善；D. 免疫组化显示移植后的ciCEC附着于后弹力层；E. 前节OCT显示移植组角膜水肿改善；F-G.移植后角膜厚度和角膜透明度的变化趋势，移植组和对照组有显著差异；H. 角膜共聚焦成像证实了移植眼内多角形细胞完全覆盖后弹力层
本研究利用小分子分两步诱导MEFs转分化为ciNCCs和功能性ciCECs，对神经嵴下游组织细胞的再生具有重要价值。该方案绕过了iPSCs阶段，克服了体外扩增能力差及潜在至瘤风险等问题，有潜力成为角膜工程和再生的理想生物来源。
信 源
Pan SH, Zhao N, Feng X, Jie Y, Jin ZB. Conversion of mouse embryonic fibroblasts into neural crest cells and functional corneal endothelia by defined small molecules. Sci Adv. 2021;7(23):eabg5749. Published 2021 Jun 4. doi:10.1126/sciadv.abg5749
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