OPINION
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SCIENCE
4月17日是第36个“世界血友病日”，今年中国的主题为“认识出血性疾病，积极预防和治疗”。血友病属于出生缺陷的一种，是由于遗传性的基因缺陷而造成血液中缺乏某一种“凝血因子”。表现为出血时间延长，患者可能因一些微小创伤而出现出血过多或反复出血的现象。而当患者出现深部脏器出血或需要手术治疗时，甚至可能会发生出血不止危及生命的情况。
血液中的凝血因子是一系列帮助血液凝固的蛋白质，在出血凝血过程中协同作用，缺一不可。主要有十三种凝血因子，但凡机体内缺乏任何一种，都会导致血液不易凝固。血友病A型是缺少第八凝血因子（FⅧ），B型缺少的是第九凝血因子（FⅨ），更为罕见的是C型，缺少第十一凝血因子。据报道，中国血友病患病率为（2.73-3.09）/10万，其中80～85%为A型，且绝大多数患者为男性。这是因为血友病是X染色体连锁的隐性遗传病，即由位于X染色体上的凝血因子基因突变引起。
基因是DNA编码中的一段，通常隐含重要的生命信息，指导细胞在合适的时间和地点制造出正确的蛋白，而蛋白是维系生命功能的重要物质。目前已知人类有三万五千到四万个基因，有些可能作用于指导细胞分泌各种激素，如生长激素和性激素帮助生命成长；也有些编码表达功能蛋白，如各种消化酶，帮助生命摄取物质等。但若关键基因发生错误，就会导致细胞制造错误蛋白而不能执行应有功能，致使疾病发生。
凝血因子作为人体一种功能蛋白，一旦血管破裂出血即被激活，能和血小板黏连以补塞血管上的破洞，产生止血效应。而血友病人自身无法产生足够凝血因子，一般会采用替代疗法帮助止血，即注射相应缺乏的凝血因子制剂，或者直接输入冷冻血浆。在我国，标准的预防性治疗：A型血友病需每周注射2~3次，B型血友病每周则至少1次注射。血友病极大地影响了患者的生活质量，也给家庭带来巨大的经济压力，但是替代疗法也仅仅只是治标，血友病的根治目前只能依靠基因治疗。
然而，基因治疗是典型的“说比做容易”。理论上，只要通过对突变致病基因进行纠正或置换，将正确基因导入靶细胞内，并表达出需要的功能蛋白或者表达抑制错误蛋白，就能达到治疗疾病的目的。但若想真正实现这个目的却需要众多步骤和考量，主要有：选择正确的目的基因、采用合适的基因导入方法以及目的基因能在靶细胞中产生效应（基因表达）。
靶细胞的选择相对简单。因伦理关系，目前基因治疗的靶细胞主要为体细胞。选择能够表达所需功能蛋白等细胞，基因递送方式可分成为体内（in vivo）基因导入和体外（ex vivo）基因导入两大类。体外导入的基因治疗，如治疗癌症的 CAR-T 治疗（见《第二十期：天价的CAR-T治疗是怎样的“神药”？》）。通过取出患者的T-细胞大量培养，并在实验室中导入特定基因后，再将细胞送回体内。体内导入的基因治疗则是通过特定载体或递送系统将目的基因片段送入细胞内，使目的基因稳定存在于胞质中并于细胞生存期内修复或补充缺陷基因，利用“细胞工厂”表达产物帮助机体恢复功能。这里我们将重点讨论体内导入的基因治疗。
选择特定载体或递送系统将目的基因片段送入细胞内，是基因治疗产品成功的关键。需要根据载体特性、临床适应症、作用机制及给药途径等，进行多方面的综合考量。虽然基因治疗中的载体或递送系统的种类繁多，但现阶段多为病毒和质粒 DNA 。以病毒载体为例：基因治疗常见病毒载体类型包括腺病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺相关病毒载体及痘病毒载体等。根据载体携带的核酸是否整合至靶细胞基因组，可分为整合型和非整合型病毒载体；根据载体的复制特性，可分为非复制型、条件复制型和复制型病毒载体。总之，用作载体的病毒必须去除原有毒性，且需要有免疫原性及致病性等安全性和有效性的保证。另外，载体的作用机制、靶向特性、整合风险、对目的基因的稳定性及表达时效等影响因素，都需要全面衡量。然而，对这些错综复杂的因素的分析抉择只是研发基因治疗产品的挑战之一。
目的基因的设计也是一道相当复杂的难题。在基因治疗中，目的基因是主要发挥治疗或调节作用的基因序列及相关调控元件，常见如功能蛋白的编码序列、靶向结合的核酸转录序列等。目的基因的选择和设计需考虑疾病的发病机制、产品的作用机制、人种间的序列差异，以及基因表达产物的免疫原性、功能活性和安全性等。由天然序列经密码子优化、基因突变、重组、插入、缺失和/或重排等修饰改造而来的目的基因，需有充分改造依据，并通过体外和/或体内研究确认序列设计的合理性。目的基因需有一定的稳定性，再配合上调控元件需有靶向特异性和组织表达特性，无致瘤风险及脱靶风险等安全性要求。而目的基因与递送系统的结合既不能影响递送系统导入功能，也不能影响递送系统的靶向性，更不能出现安全性风险。而这些仅仅是基因治疗产品的设计起点，从设计到生产过程则又是另一番道阻且长。
20世60年代，基因治疗的概念由1958年诺贝尔奖获得者乔舒亚·莱德伯格（Joshua Lederberg）首次提出，直到1972 年基因疗法才被正式认可。历经近半个世纪的艰辛尝试与无数次基因治疗临床试验的成败起伏，终于迎来了基因治疗时代。2017年12月，Luxturna成为首个获批的体内基因治疗药物，用于治疗一种特定基因缺陷导致的先天性失明症。它利用重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus，rAAV）作为载体，结合工作拷贝的RPE65基因（目的基因），通过直接注射入患者视网膜，使视网膜细胞（靶细胞）中产生正常的RPE65酶。如果患者还拥有足够存活数量的视网膜细胞，RPE65基因就可以表达出足以使患者恢复或改善视力功能蛋白。
相较于生理状态处于免疫赦免状态的视网膜，血友病的基因治疗的难点首先来自免疫抑制。利用同样的 rAAV 载体对 B 型血友病进行基因治疗，却因患者本身存在的 AAV 抗体而失败。表现为基因治疗产品输注后，AAV 病毒衣壳会引起迟发型的细胞免疫应答，进而导致转导细胞被免疫系统破坏，不能表达需要的凝血因子。而目的基因的大小又是另一个问题。一般rAAV可携带4.5 kb左右的DNA序列，而FⅧ基因cDNA全长为 9 kb，加上启动子等表达调控元件后，超过了AAV 的载荷极限，包装效率非常低，也影响了A型血友病的基因治疗效果。
科学研究从来都不会放弃，通过对rAAV血清型研究，发现不同血清型的rAAV载体衣壳蛋白有所不同。通过选择免疫应答较低的AAV5为载体；通过截短FⅧ的cDNA使其可以被AAV5所包裹；通过增加糖皮质激素的剂量和疗程，可降低对AAV衣壳产生的延迟免疫排斥反应，并延长FⅨ（或FⅧ）的表达时间，等一系列设计。首个适用于B型血友病的基因治疗产品Hemgenix®已于2022年11月获得批准，首个适用于A型血友病的基因治疗产品Roctavian®也已于2023年6月获得批准，生产企业均称可以一针治愈，免除患者输注凝血因子或输血需要。
虽然临床试验数据表明基因治疗给血友病患者带来极大益处，但其高昂的价格却令人望而生畏。一剂Hemgenix报价350万美元，Roctavian的售价为290万美元。虽然目前治愈遗传缺陷性疾病的出路尚在基因治疗，但真正实现基因治疗的可及性则需要脱下昂贵的外衣。
除了高昂的价格，基因治疗技术也存在较大改进空间。随着对病毒载体安全性和有效性的提升，以及CRISPR-Cas 9基因编辑技术的进步，科学家们正致力将基因治疗推向更高效率、更具特异性和安全性的目标努力。尽管起初基因治疗仅被用于遗传性疾病领域，而现在正被广泛扩展至肿瘤、感染性、心血管和自身免疫性等多种疾病的治疗。基因治疗未来可期！
参考文献：
1. 中华医学会血液学分会血栓与止血学组，中国血友病协作组。血友病治疗中国指南（2020年版）
2. Rangarajan S, Walsh L, Lester W, et al. AAV5-factor VIII gene transfer in severe hemophilia A [J]. N Engl J Med, 2017, 377(26): 2519-2530.
3. 李晓兰，张健萍，张磊，等。血友病A基因治疗的研究进展[J]中华血液学杂志2015, 36(7):620-625.
4. 陈曦，陈亮，李大力。基因治疗在临床应用中的研究进展[J]生物工程学报2019，35(12): 2295−2307.
5. 体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）2022年5月https://www.cde.org.cn/main/news/viewInfoCommon/c0ec5e347ba84df67bf75e15f6ad3f3f
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