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导读
葡萄膜黑色素瘤（UM）是一种罕见但致命的眼内原发性恶性肿瘤，传统治疗方法疗效有限，其远端转移是患者死亡最主要的原因。一旦发生转移，患者几乎无药可用，死亡率可达90%以上。近日，一项发表在《Free Radical Biology and Medicine》上的题为“Erdafitinib Promotes Ferroptosis in Human Uveal Melanoma by Inducing Ferritinophagy and Lysosome Biogenesis via Modulating the FGFR1/mTORC1/TFEB Signaling Axis” （DOI: 10.1016/j.freeradbiomed.2024.07.002.）的研究揭示了口服泛FGFR抑制剂 Erdafitinib 在治疗 UM 中的潜在价值，为 UM 的治疗带来了新的希望。
研究概况
本研究主要探讨了选择性泛FGFR抑制剂Erdafitinib在UM中的抗肿瘤效果及相关的作用机制。总结如下：
1、通过体外和体内模型证实，Erdafitinib通过诱导铁死亡（ferroptosis）在FGFR1依赖的方式下展现出强大的抗肿瘤活性。Erdafitinib显著减少了UM异种移植小鼠模型中的肿瘤生长，这一效果与FGFR1表达水平的降低密切相关。
2、转录组数据显示，Erdafitinib通过调节铁蛋白吞噬（ferritinophagy）和溶酶体生物发生（lysosome biogenesis）来实现其抗癌效果。
3、进一步研究发现，Erdafitinib通过降低FGFR1的表达和抑制UM细胞中mTORC1的活性来发挥作用，同时增强TFEB的去磷酸化、核转位和转录活性。TFEB在核内的聚集触发了依赖于FTH1的铁蛋白吞噬，导致溶酶体激活和细胞内铁过载。
综上所述，本研究首次证明Erdafitinib通过调节FGFR1/mTORC1/TFEB信号来协调铁蛋白吞噬和溶酶体生物发生，从而强效地诱导UM的铁死亡。
研究结果
1、FGFR1 在葡萄膜黑色素瘤患者中过度表达，并与不良临床预后有关
已有研究表明，FGFR1 及其配体在原发性 UM 肿瘤和细胞系中过度表达。此外，干扰 FGFR1 信号通路可显著降低 UM 细胞系的细胞增殖率和存活率。利用 TCGA-UVM数据库中检索获得的RNA-seq数据和临床病理学参数，发现 FGFR1 在 UM 组织中表达上调，并与肿瘤分期、远处转移和不良预后相关。FGFR1在III期和IV期的表达明显高于II期。在远处转移的肿瘤标本和导致死亡的病例中检测到FGFR1水平升高。此外，FGFR1的表达与UM的恶性行为相关，进一步评估预后值。通过建立OS的Kaplan-Meier曲线，发现FGFR1的过度表达与较短的OS（总生存期）显著相关。
2、泛FGFR受体抑制剂Erdafitinib可抑制 UM 细胞的增殖
使用 FGFR1高表达的UM 细胞系 92.1 和 Mel202，以及人视网膜色素上皮细胞系 ARPE-19 作为正常细胞对照，检测了Erdafitinib的细胞毒性功效。这些结果表明， Erdafitinib 以剂量依赖性的方式强烈抑制两种UM细胞系的细胞活力。相比之下，Erdafitinib在ARPE-19细胞中的细胞毒性最小。使用Erdafitinib治疗后，FGFR1的蛋白表达在两个UM细胞系中都以剂量依赖性的方式显著下调。进一步的分析结果表明Erdafitinib在UM细胞中诱导的细胞死亡并不是通过传统的凋亡机制进行的。
3、Erdafitinib以FGFR1依赖性方式促进UM细胞中的铁死亡
使用FGFR1高表达的UM细胞系92.1和Mel202，并用不同浓度的Erdafitinib处理，研究Erdafitinib是否会诱导UM细胞坏死或铁死亡。结果显示，Erdafitinib治疗以剂量依赖性方式影响MDA、GSH和铁含量，而LDH的释放量保持不变。使用脂质过氧化特异性探针C11-BODIPY581/591检测，结果显示，在使用Erdafitinib后，观察到的荧光以药物剂量依赖的方式从红色转变为绿色，这表明Erdafitinib可能会引发UM细胞中的铁死亡。 使用siRNA和pcDNA3.1-FGFR1质粒分别敲低和过表达FGFR1基因，观察其对Erdafitinib诱导的细胞死亡的影响。敲低FGFR1影响MDA、GSH和细胞内的铁含量，其结果与Erdafitinib治疗后观察到的相似。此外，过表达FGFR1显著减弱了这两种细胞系中Erdafitinib诱导的细胞反应。这些结果表明Erdafitinib可能是通过FGFR1依赖性机制发挥抗UM作用的。
4、Erdafitinib通过诱导铁蛋白吞噬/溶酶体生物发生触发铁死亡
对Erdafitinib处理后的92.1细胞进行转录组测序，分析差异表达基因及其功能富集，结果显示，差异表达基因（DEGs）主要富集在 "信号受体活性调控 "类别中，且在 PI3K/AKT 信号通路、MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）信号通路和铁死亡通路中的富集程度最高。对DEGs热图的分析显示，Erdafitinib处理显著上调了92.1细胞中与铁蛋白吞噬和溶酶体生物发生相关的基因的表达。随后，评估了Erdafitinib处理前后的92.1细胞在转录和翻译水平上铁蛋白吞噬和溶酶体标志物的表达水平。与RNA-seq结果一致，Erdafitinib处理显著上调铁蛋白吞噬货物受体NCOA4、溶酶体相关膜蛋白1（LAMP1）和组织蛋白酶B（CTSB）的mRNA和蛋白质表达。然而，转录和翻译水平上铁蛋白重链1（FTH1）的变化并不一致。这些结果表明，Erdafitinib诱导的92.1细胞铁死亡可能是由上调铁蛋白吞噬和溶酶体生物发生的介导的。
5、Erdafitinib通过调节mTORC 1/TFEB信号传导诱导铁蛋白吞噬/溶酶体生物发生
TFEB（Transcription Factor EB）是铁蛋白噬菌体和溶酶体生物发生的关键调控因子，其活性由其磷酸化状态精密调控，而TFEB的磷酸化状态又受哺乳动物雷帕霉素复合物1（mTORC1）的影响。在92.1细胞中研究了Erdafitinib对mTORC 1/TFEB信号传导的影响。结果显示，Erdafitinib可诱导mTORC1失活，从而导致TFEB Ser-211磷酸化减少、分子量位移、核转移，TFEB从TFEB/YWHA复合物中解离。为了进一步探讨Erdafitinib诱导的细胞铁死亡是否是mTORC1/TFEB介导的铁蛋白吞噬/溶酶体生物发生的结果，L-亮氨酸（L-leu，0.5mM）用于激活mTORC1，或用siRNA敲低TFEB。结果表明，TFEB的敲低部分逆转了Erdafitinib诱导的UM细胞的细胞毒性，表明Erdafitinib通过TFEB介导的信号转导表现出其功效。L-亮氨酸激活mTORC1显著改变了TFEB的磷酸化状态和亚细胞定位。磷酸化的TFEB被保留在细胞质中，阻碍了其对铁蛋白吞噬和溶酶体生物发生的调节作用。这些结果表明，Erdafitinib可能通过调节mTORC 1/TFEB信号通路触发铁蛋白吞噬/溶酶体生物发生。
6、Erdafitinib通过调节FGFR1/mTORC 1/TFEB信号轴诱导铁蛋白吞噬/溶酶体生物发生
为了探讨FGFR1参与Erdafitinib对mTORC1/TFEB信号通路的调节作用，在92.1细胞中使用siRNA敲低FGFR1或使用pcDNA-FGFR1载体过表达FGFR1。FGFR1的敲低引起了类似于Erdafitinib处理诱导的细胞反应，其特征是S6K（T389）和TFEB（S211）的去磷酸化、TFEB/YWHA复合物的解离和TFEB移位到细胞核中，相反，FGFR 1过表达显著逆转了暴露于Erdafitinib的92.1细胞中mTORC 1活化的抑制，减轻了Erdafitinib处理引发的TFEB介导的铁蛋白吞噬和溶酶体生物发生，这些发现表明Erdafitinib通过调节FGFR 1/mTORC 1/TFEB信号传导轴刺激铁蛋白吞噬/溶酶体生物发生。
7、Erdafitinib在92.1异种移植模型中抑制肿瘤生长
最后，通过构建UM异种移植瘤小鼠模型，分析Erdafitinib对UM肿瘤组织的影响。与对照组相比，Erdafitinib治疗导致病灶体积显著减少。为了直观地观察肿瘤病灶的体内生长状态，使用一种用于非侵入性靶向整合素αvβ3的放射示踪剂[18F]F-NOTA-PRGD2对小鼠进行了PET扫描，对照组肿瘤中对放射示踪剂的摄取明显高于Erdafitinib治疗组。免疫组织化学染色结果显示，Erdafitinib 能够有效抑制肿瘤生长，并降低肿瘤组织中 FGFR1 的表达。
结论
本研究首次证明了Erdafitinib在UM的体外和体内模型中都具有强大的抗肿瘤活性，该作用依赖于FGFR 1的下调。Erdafitinib通过阻断FGFR 1/mTORC1信号传导并增强TFEB介导的铁蛋白吞噬和溶酶体生物发生来诱导UM细胞铁死亡。这些研究结果表明，Erdafitinib具有作为UM治疗药物的巨大潜力，FGFR1有希望成为对抗这种致命癌症的治疗靶点。
