罗盛康
广东省第二人民医院
广东省第二人民医院整形美容科主任、学科带头人
中国整形美容协会微创与皮肤整形美容分会会长
主任医师、博士研究生导师
微针经皮给药技术作为一种新兴的给药方式，具有突破角质层屏障，实现血药浓度维持恒定、无胃肠刺激和肝脏首过效应、局部药物靶向性好、患者依从性高等优势，成为皮肤美容领域的研究热点。
广东省第二人民医院整形美容科罗盛康教授课题组与华南理工大学任力教授课题组于2024年7月27日在国际知名期刊International Journal of Biological Macromolecules（IF=7.7）共同发表题为Functional hyaluronic acid microneedles for skinphotoaging based on collagen induction andoxidative stress regulation strategies的研究论文。该研究对透明质酸进行功能化修饰，并结合可溶性微针技术，制备出一种新型微针阵列贴片，可促进胶原蛋白再生、减轻皮肤损伤及抑制氧化应激，有效改善皮肤光老化。
光老化对皮肤健康和衰老具有重要意义。紫外线（UV）照射导致细胞外基质（ECM）微环境的破坏，胶原蛋白的降解和氧化应激的产生。传统的透明质酸（HA）刺激胶原再生的能力较弱，其作为一种大分子的渗透性较差而受到阻碍，最终导致光老化治疗的治疗结果受限。本研究采用富含磺酸或富磷脂酰胆碱聚合物对HA进行功能修饰制备HA/PX，可以补充ECM的缺失，改善UVB诱导人成纤维细胞（HDFs）和无毛小鼠模型的光老化。结果表明，与HA相比，HA/PX在延缓细胞衰老、促进胶原再生和抵抗活性氧（ROS）方面具有更优越的能力。此外，HA/PX在体内外均具有良好的生物相容性，无过敏或其他不良反应。我们还证明了通过微针阵列（MNs）经皮传递HA/PX可以显著减轻光老化裸鼠的皱纹和皮肤损伤，并通过增强表皮厚度、促进胶原沉积和减少氧化应激来实现皮肤光老化的治疗。因此，我们的研究为未来的抗衰老治疗策略提供了一种新的可能性。
透明质酸修饰聚合物（HA/PX）
透明质酸（HA）是维持皮肤水分平衡和弹性的重要因素；蛋白聚糖负责连接各种细胞和蛋白质。磷脂在皮肤表面形成一种天然屏障，防止水分流失，并帮助维持细胞通讯。
本研究合成了两种透明质酸聚合物，分别为HA/PA（2-丙烯酰胺-2 甲基丙磺酸钠盐）和HA/PM（2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱），来模拟皮肤真皮层细胞外基质（ECM），补充和调节皮肤老化引起的细胞外微环境，二者的混合物称为HA/PX。基于胆碱磷酸基和磺酸基的亲水性，HA/PA和HA/PM具有比HA更好的吸水性和保湿性能。
图1 HA/PA和HA/PM的制备和保湿能力。（a）整体概念说明。（b-c）HA/PA和HA/PM的化学结构式。（d-e）材料保湿性能评价：在37℃和50%相对湿度下的吸水性能和保持率。
人成纤维细胞（HDFs）是皮肤组织中的主要细胞，负责细胞外基质的生成和内稳态的维持。光损伤的HDFs表现出胶原降解，基质金属蛋白酶增加，并抑制转化生长因子的合成，这些因素最终导致ECM的减少。
为了评估HA/PX的体外抗光老化潜力，我们研究了其对HDFs的增殖、迁移和功能的影响。结果显示（图1b），与UVB-HA和UVB组相比，UVB-HA/PA、UVB-HA/PM和UVB-HA/PM组能够显著促进光老化HDFs细胞的增殖。
利用酸性环境中衰老细胞激活β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）来检测和量化HDFs细胞的衰老程度（图1c-d）。与对照组相比，UVB和UVB-HA组具有更强的蓝绿色SA-β-Gal染色，而UVB-HA/PA和UVB-HA/PM组能有效抵消UVB的光老化效应，未染色细胞的百分比分别是UVB组的5.4倍和5.6倍。
HDFs通过平衡基质分子如Col-I和Col-III、转化生长因子-β1（TGF-β1）和基质金属蛋白酶1（MMP-1）等降解酶的合成来维持ECM稳态。如图1e所示，透明质酸修饰聚合物材料通过上调Col-I、Col-III、TGF-β1 mRNA水平，并下调MMP-1 mRNA水平，提高光老化细胞中的胶原合成来抵消紫外线诱导的胶原降解，从而维持ECM的完整性，且HA/PX具有最佳的治疗效果。
图2 HA/PA、HA/PM和HA/PX对UVB诱导的人皮肤成纤维细胞（HDFs）光老化的影响。（a）UVB诱导的HDFs光老化模型和培养过程示意图。（b）HDFs暴露于100 mJ/cm2 UVB后加入HA/PX培养第1、3和5天的活性。（c-d）通过β-半乳糖苷酶染色，观察到HA/ PX对HDFs衰老的有益作用。（e）检测Col-I、Col-III、TGF-β1、MMP-1基因mRNA的表达量。
皮肤暴露于UVB会触发有害活性氧的产生，激活氧化应激相关的途径，损害细胞DNA、蛋白质和脂质，促进炎症反应，破坏机体的活力，因此，活性氧的消除可以减缓甚至防止光老化。
用DCFH-DA作为荧光探针检测HDFs中的ROS水平（图3a）。在UVB刺激后24小时内，HDFs细胞内检测到强烈的DCF荧光信号，表明ROS水平显著升高。加入HA/PA、HA/PM和HA/PX后，HDFs细胞内活性氧含量有不同程度的下降，明显优于添加HA组，其中HA/PX组的荧光信号最弱（图3b）。
此外，HA/PA、HA/PM和HA/PX显著上调抗氧化酶物质超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）水平，下调膜脂过氧化产物丙二醛（MDA）水平，以及具有清除ABTS+⋅、DPPH⋅和⋅OH等自由基的能力。
图3 HA/PX清除活性氧，促进HDFs中抗氧化酶的表达。（a-b）荧光显微镜下UVB照射后不同组HDFs的ROS含量。(c) SOD、(d) GSH和(e)检测HA、HA/PA、HA/PM和HA/PX光损伤HDFs中脂质过氧化的表达。（f-g）HA、HA/PA、HA/PM和HA/PX清除ABTS+⋅、DPPH⋅和⋅OH自由基的能力。
功能化修饰透明质酸微针贴片（HA/PX@MNs）
HA/PX@MNs的制备过程如图4a所示，用聚二甲基硅氧烷（PDMS）作为模具制备锥形微针阵列，通过真空干燥法将HA/PA和HA/PM溶液填充到模具中，形成微针尖端，然后用10%HA和PVA混合溶液作为基底，形成完整的微针贴片。
HA/PX@MNs呈锥形尖端形状，微针体表面光滑，无小气泡或裂纹。微针的尺寸分布相当均匀，每个微针的基部直径约为392μm，高度集中在860-900μm之间，能够穿透皮肤的表皮层，并进入真皮浅表处349 μm以发挥作用（图4b-i）。刺入1 min后，HA/PX@MNs开始逐渐溶解，15 min后完全溶解（图4j）。
在去除微针的基部后，在给药部位的皮肤表面留下可见的针孔和压痕痕迹，这些标记在10 min左右内消失，而不会引起任何持久的皮肤刺激或标记（图4k）。
综上所述，HA/PX@MNs具有足够的高度和力学性能，可以在短时间内经皮传递HA/PX大分子，而不会引起有害的皮肤反应，具有良好的临床应用前景。
图4 HA/PX@MNs斑块的形态学特征和力学性能的制备和表征。（a）透明质酸基微针的制备工艺示意图。（b-e）微针贴片的光学图像。（f）针尖底部的直径分布。（g）针尖的高度分布。（h）微针贴片中每根针的平均轴向应力。（i）插入猪耳皮肤组织的贴片的H&E染色。（j）透明质酸基MN贴片的尖端随着时间的推移被压在皮肤中的过程。（k）去除贴片后，皮肤随时间的变化过程。
由于HA/PX@MNs需要皮下作用，因此在临床应用之前，其安全性必须在生物体中进行验证。在第1、4、7和14天进行经皮注射，并持续观察此期间小鼠的生理状态，直到第21天（图5a）。
实验结果证实微针在体内是安全的。治疗后，小鼠的体重继续以稳定的速度增加，表明微针对小鼠的饮食和代谢没有不良影响（图5b-d）；其次，血糖、肝肾功能相关生化指标处于正常水平（图5e-f），且关键免疫器官心、肝、脾、肺、肾的组织形态无不良影响，也没有明显的炎症刺激（图5g）。
图5 HA/PX@MNs的生物安全性评价。（a）HA/PX@MNs在小鼠体内安全性评价实验设计。（b）小鼠体重。治疗最后一周各组小鼠每日（c）饮食和（d）水摄入量。(e)小鼠在第21天的血糖水平。（f-g）治疗结束时，对每组小鼠的进行血液生化分析和主要免疫器官心、肝、脾、肺、肾H&E染色切片。
采用传统的光老化裸鼠模型，小鼠被暴露于UVB辐射下超过8周，以诱导其背部出现皱纹和皮肤损伤。在第0、3、7、13天时将MNs刺入真皮以恢复功能，直至第21天。
对照组小鼠皮损严重，皱纹增多；HA@MNs组病变和红斑减少，但皮肤仍然粗糙干燥，仍有一些深皱纹可见。相比之下，HA/PA@MNs、HA/PM@MNs和HA/PX@MNs处理的小鼠表现出更薄和更浅的皱纹。且HA/PX@MNs治疗组的皱纹逆转效果最好，皮肤表面更光滑、更有弹性，皮肤水化水平更高。
H&E图像显示，UVB辐射后，除假手术组外，所有组小鼠均过度生长导致角质形成细胞，表皮增厚，同时真皮胶原降解。胶原纤维的分布和结构完整性不规则。HA/PX@MNs可有效恢复表皮正常厚度、促进胶原蛋白沉积、使表皮结构更加连续（图6a-d）。
IL-6是一种主要参与调节免疫和炎症反应的细胞因子。在老化的皮肤中，紫外线辐射可以刺激细胞产生和释放过量的IL-6诱发炎症。HA/PX@MNs同样显著抑制了IL-6在表皮中的表达（图6e）。
图6 HA/PX@MNs对小鼠抗衰老治疗的组织学评价。（a）从上到下，真皮和表皮层H&E染色，脂肪层H&E染色，Masson三色染色，小鼠皮肤IL-6免疫组化染色。（b）小鼠表皮的厚度。（c）小鼠真皮层的厚度。(d)真皮层的胶原蛋白体积分数。（e）IL-6在表皮中的表达。
采用DHE染色法检测小鼠皮肤组织中ROS的水平。HA/PX@MNs治疗后，DHE信号的荧光强度（红色）下降（图7a-b），这表明组织内超氧化物生成减少，ROS水平降低。此外，血液中抗氧化酶SOD活性也显著升高（图7c）。因此，HA/PX@MNs可以有效地抵消光老化皮肤中的氧化应激现象。
图7 评价HA/PX@MNs清除光老化小鼠皮肤中ROS的能力。小鼠皮肤的（a） DHE染色和荧光强度的（b）定量分析。（c）小鼠血液中SOD的浓度。
总结
本研究以透明质酸为主链，分别以带磺酸基的PAMPS和带磷酸胆碱基的PMPC为侧链，合成出两种功能化修饰的透明质酸聚合物HA/PA和HA/PM，可模拟皮肤ECM的蛋白聚糖和磷脂，促进体外光老化细胞模型的胶原再生，抑制MMP-1的表达，从而平衡ECM中的微环境变化，同时还具备优异的抗氧化能力，抑制光老化细胞中活性氧的产生。
为了提高HA/PA和HA/PM的皮肤吸收，我们将这两种功能化修饰的透明质酸聚合物制备成一种安全高效的可溶性微针系统HA/PX@MNs。本研究初步证明了HA/PX@MNs可将功能化修饰的HA递送到真皮浅层，调节表真皮厚度、增加胶原蛋白的表达与分布、恢复胶原纤维的结构完整性、抑制氧化应激，从而实现皮肤光老化的改善作用。
我们期待未来在更大的样本、更多的变量和更深入的研究中对HA/PX@MNs进行更广泛的测试和评估，为UV诱导的皮肤光老化治疗提供有效和安全的新选择。
参考文献
Tang Z, Liu Z, Zhang Y, Luo S, Xu Y, Ren L. Functional hyaluronic acid microneedles for skin photoaging based on collagen induction and oxidative stress regulation strategies. Int J Biol Macromol. 2024 Jul 27;277(Pt 2):134080.
本文作者：白鹭
审阅、修订：海琅
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