远想医学研究院｜PD-L1表达的外泌体可促进创面愈合

教授介绍

程芳

中山大学药学院（深圳）副教授/博士生导师

IF=16.0

亮点： 

1. 研究者从受到 IFN-γ刺激的细胞或过表达 PD-L1 的基因工程细胞中分离出外泌体 PD-L1。 

2. 研究者发现外泌体 PD-L1 导致 T 细胞增殖减少，在体外加速皮肤细胞迁移，同时在体内促进伤口愈合。 

3. 当外泌体 PD-L1 被纳入 PF-127 热响应性水凝胶中，涂抹于小鼠皮肤切口伤害部位，能够在炎症阶段明显减少脾脏和淋巴结中的 CD8 +T 淋巴细胞。 

4. 这些结果揭示了外泌体 PD-L1 的新型免疫抑制功能，并为增强 PD-1/PD-L1 免疫检查点通路促进组织修复和再生提供了证据。 

2019 年 12 月 27 日，中山大学药学院（深圳）的研究人员在《Journal of Extracellular Vesicles 》 期 刊 发 表 了 题 为 ：Exosomal PD-L1 functions as an immunosuppressant to promote wound healing 的研究文章。 

背景

外泌体携带包括蛋白质、脂质和核酸在内的多种货物，可以在细胞之间进行传递和交换，并影响受体细胞的各种生理和病理功能。 

外泌体已被证明通过多种机制抑制过度活跃的免疫反应，包括抑制自然杀伤细胞（Natural killer cells，NKs）和 CD8 +T 细胞的活动，防止树突状细胞（Dendritic cells，DCs）的分化和成熟，以及积极介导调节性 T 细胞（Tregs）的功能。这些外泌体具有作为组织再生和免疫应答调节的直接治疗药物的潜力。 

最近发现 PD-L1 阳性的外泌体从转移性人类黑色素瘤细胞分泌到肿瘤微环境和循环中，系统性地抑制抗肿瘤免疫。PD-1+ CD8 +T 细胞是受外泌体 PD-L1 抑制以减缓效应阶段的免疫压力的主要靶细胞。这种 T 细胞抑制可以通过抗体阻断外泌体 PD-L1 与 T 细胞上的 PD-1 之间的相互作用而被打破。 

在这项研究中，研究者从受到 IFN-γ刺激的细胞或过表达 PD-L1 的基因工程细胞中分离出外泌体 PD-L1。研究者发现外泌体 PD-L1 导致 T 细胞增殖减少， 在体外加速皮肤细胞迁移，同时在体内促进伤口愈合。此外，当外泌体 PD-L1 被纳入 PF-127 热响应性水凝胶中，涂抹于小鼠皮肤切口伤害部位，能够在炎症阶段明显减少脾脏和淋巴结中的 CD8 +T 淋巴细胞。这些结果揭示了外泌体 PD-L1 的新型免疫抑制功能，并为增强 PD-1/PD-L1 免疫检查点通路促进组织修复和再生提供了证据。 

将 PD-L1 包装到黑色素瘤细胞衍生的外泌体

有研究表明，在癌细胞和来源于癌细胞的外泌体表面均表达 PD-L1，尤其是 在 IFN-γ刺激的下。为了测试癌细胞中过表达 PD-L1 是否也增加了 PD-L1 在外泌体中的分泌，研究者使用慢病毒感染人黑色素瘤细胞 SK-MEL-5，得到一个稳定表达人类 PD-L1 的细胞系。为了控制外泌体中其他免疫相关蛋白的影响，研究者还建立了一个 PD-L1 敲除的 SK-MEL-5 细胞系（Pd-l1 -/-）。通过 qPCR、 WB 验证以上各组结果（图 1a 和 b）。各组外泌体中总蛋白质量几乎相同（图 1c）。透射电子显微镜图像显示大多数外泌体囊泡呈圆形且被膜包围（图 1d）。动态光散射（Dynamic light scattering，DLS）分析（图 1e 和 f）。 

外泌体 PD-L1 抑制 T 细胞活化，促进皮肤细胞体外迁移 

PD-L1 过表达的外泌体与细胞表面上的 PD-1 发生物理相互作用（图 2a 中小 红点）。预先染色的 PD-L1 过表达的 SK-MEL-5 细胞来源的外泌体与 HEK 293T 细胞膜上的外源 GFP-PD-1（图 2b）以及 Jurkat T 细胞表面的内源 PD-1（图 2c） 共定位。 

来自 IFN-γ处理的细胞（WT+IFN-γ，Pd-l1 -/-+IFN-γ）的外泌体抑制了外周血单核细胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMC）的增殖（图 2d）。 

相比之下，来自表达外源 PD-L1 的 SK-MEL-5 细胞的外泌体（WT+PD-L1）更为剧烈地抑制了 PBMC 的增殖，而对照的 WT 和 PD-L1 -/-外泌体与对照组（Ctrl (d3)）相比对 T 细胞增殖无影响（图 2d）。 

当比较来自 IFN-γ处理的细胞（Pd-l1 -/-+IFN-γ）和 PD-L1 过表达的细胞 （WT+PD-L1）与对照组之间更多轮次的增殖（7 天）时，观察到了更为显著的差异，进一步证明外泌体的主要免疫抑制效应来自于 PD-L1 而不是外泌体中的其他免疫相关蛋白（图 2e）。 

皮肤细胞的伤口划痕实验表明，外泌体 PD-L1 还调控着皮肤修复所需的表皮和真皮细胞过程（图 2f 和 g）。

从 PF-127 水凝胶中持续释放外泌体

为了提高外泌体的治疗效果，研究者将外泌体并入 PF-127 水凝胶中，以持续释放外泌体到周围环境。

首先，研究者评估了水凝胶的溶解。在 20% PF-127 浓度下，溶液-凝胶转变温度为 24℃，这意味着在低温下聚合物处于溶液状态，但在接近体温时凝固（图 3a）。接下来，我们通过在从 5℃到 40℃逐渐升温的条件下测量弹性模量（G′） 和粘性模量（G″）来确认 PF-127 水凝胶的物理性质，并显示 PF-127 溶液向水凝胶的相变发生在温度升至约 17℃时（图 3b）。 

PF-127 水凝胶形态的扫描电子显微镜（Scanning electron microscopy，SEM） 图像显示平均孔径约为 4 μm（图 3c），为体内注射提供了显著的优势。 

为了检查 PF-127 水凝胶是否能够提高体外外泌体的保持力和稳定性，我们将 10 μg 带有 WGA 488A 染料标记的外泌体与 200 μL PF-127 水凝胶混合，并在 37℃下凝胶化。在 37℃湿润培养箱中保存不同时间后，通过在不同时间点定量 GFP 信号来评估水凝胶中外泌体的稳定性（图 3d 和 e）。随着共培养时间的增加，GFP 信号逐渐增加，达到 24 小时共培养的峰值，然后缓慢减少（图 3d 和 e）， 表明外泌体不断从 PF-127 水凝胶中释放到周围细胞。 

外泌体 PD-L1 促进体内皮肤伤口愈合

基于与创伤愈合过程相关的细胞模型的观察，研究者希望调查外泌体 PD-L1 是否是生理环境中伤口愈合的重要决定因素。因此，研究者在小鼠背部皮肤进行全层次的切口伤害（直径 10 mm）。鉴于这类小鼠的体表面积相对较小，伤口比标准尺寸要大得多，导致更强烈和更长时间的炎症，并使伤口更具挑战性。阴性对照组接受 20% PF-127 单独治疗（Ctrl），bFGF 组接受 20% PF-127 含有 bFGF 细胞因子，以及 WT 组，WT+PD-L1 组，WT+IFN-γ组接受 20% PF-127 含有来自小鼠黑色素瘤 B16F10 细胞系的外泌体，在伤口上涂抹 10 天。 

研究者发现，在外泌体 PD-L1 治疗后，WT+IFN-γ组和 WT+PD-L1 组的伤口在伤后第 10 天几乎从表面愈合，而对照小鼠（WT 组和 Ctrl 组）的上皮层仍然被一个大的痂覆盖（图 4a）。此外，WT+IFN-γ组和 WT+PD-L1 组的伤口愈合速度与阳性 bFGF 组相似。

研究者进一步比较了伤口大小，并发现在伤口愈合的 10 天内，WT+PD-L1 组和 WT+IFN-γ组的伤口比 WT 组小（图 4b），证明外泌体 PD-L1 导致组织更快地恢复。在伤口愈合 7 天的伤口形态学分析显示，在 WT+IFN-γ组和 WT+PD-L1 组与 WT 组和 Ctrl 组相比，炎症和免疫细胞浸润显著减少，伴随着上皮再生增强 （图 4c）。 

免疫组化分析使用α-SMA、vimentin 和 Ki67 抗体还显示 PD-L1 组表皮和真皮中的迁移、成熟和增殖都加速，这是正常伤口愈合的先决条件（图 4c）。 

接下来，研究者调查了受伤区域的免疫信号。qPCR 分析显示与 WT 组或 bFGF 组相比，WT+IFN-γ组和 WT+PD-L1 组的 IL6、TNF-α和颗粒酶 B 的 mRNA 水平较低（图 4d）。 

有趣的是，Ctrl 组具有更强烈的炎症和免疫细胞因子产生，表明 PF-127 水凝胶对抗感染和炎症具有保护作用（图 4d）。 

一致地，流式细胞仪分析显示在 WT+IFN-γ组和 WT+PD-L1 组中，与对照 WT 组相比，淋巴结中 CD8 +T 细胞减少，但在脾脏中没有减少，这表明将富含 PD-L1 的外泌体局部应用于受伤部位对附近的淋巴组织中的 T 细胞激活产生负面影响，但不影响脾脏等远离的淋巴器官（图 4e 和 h）。 

研究的局限性

研究者表示这种皮肤创伤模型存在其局限性，因为其他类型的损伤，如切口和烧伤模型，在病理生理条件和潜在的分子机制上略有不同。此外，在本研究中， 研究者使用的是急性切口伤愈合模型，而不是慢性模型，在慢性模型中，外泌体中的 PD-L1 可能对控制免疫炎症过程产生更强烈的影响。未来，可以使用糖尿病或银屑病小鼠模型来探索免疫信号通路对慢性炎症微环境的影响。 

总结

在本研究中，研究者从过表达 PD-L1 的基因工程细胞或经 IFN-γ刺激的细胞中获得了外泌体中高浓度的 PD-L1。研究者发现外泌体中的 PD-L1 特异性地结合到 T 细胞表面的 PD-1，并抑制 T 细胞的激活。有趣的是，预先与 T 细胞共孵育的外泌体 PD-L1 促进了表皮细胞和真皮成纤维细胞的迁移。研究者进一步将外泌体嵌入热响应性 PF-127 水凝胶中，该水凝胶在体温下凝胶化，以持续释放外泌体到周围环境。重要的是，在小鼠皮肤切口伤口模型中，嵌入水凝胶的外泌体 PD-L1 在炎症阶段显著加速了伤口收缩和上皮再生。最后，外泌体 PD-L1 抑 制了 CD8 + T 细胞的细胞因子产生，并在脾脏和外周淋巴结中抑制了 CD8 + T 细胞的数量。综合这些数据，提供了外泌体 PD-L1 发挥免疫抑制作用并促进组织修复的证据。该研究描述了外泌体中的 PD-L1 作为免疫抑制剂的新发现。这可能成为有前途的无细胞疗法，促进组织修复和再生，为新的免疫治疗提供理论和实验基础，用于治疗器官移植排斥、自身免疫性疾病、慢性感染、创伤后慢性炎症等疾病及其他领域。 

程教授长期致力肿瘤与炎症免疫性疾病的靶点发现和分子机制研究，并在研究中运用了高通量高内涵筛选、CRISPR 遗传文库药物靶点筛选、蛋白质组学筛选、单细胞转录组学等多种新技术新方法。近年聚焦于细胞外囊泡免疫调控领域研究，搭建了完善的动植物和微生物细胞外囊泡（外泌体）提取纯化、鉴定技术平台以及质量控制平台，并探索外泌体修饰和载药技术在自身免疫病、器官移植免疫排斥、组织损伤修复等适应症中的应用，取得了一系列原创性成果。近年来在 Journal of Extracellular Vesicles, ACS Nano, EMBO Mol Med, PLOS Biology, PNAS, Cell, Cell Host Microbe, PloS Pathogens, Cell Death and Differentiation，Cell Death and Disease，Acta Biomaterialia, Advanced Science 等杂志发表 SCI 论文 50 多篇，影响因子累计 500 多点，被引次数超 2000 次。申报获批国家发明专利和 PCT 专利 14 项，主持包括芬兰科学院基金、国家自然科学基金、广东省国际科技合作项目、深圳市基础研究重点项目、呼吸疾病国家重点实验室基金、中央高校重点项目培育基金等在内 20 余项科研项目。 

参考文献 

Su D, Tsai HI, Xu Z, Yan F, Wu Y, Xiao Y, Liu X, Wu Y, Parvanian S, Zhu W, Eriksson JE, Wang D, Zhu H, Chen H, Cheng F. Exosomal PD-L1 functions as an immunosuppressant to promote wound healing. J Extracell Vesicles. 2019 Dec 27;9(1):1709262. doi: 10.1080/20013078.2019.1709262. PMID: 33133428; PMCID: PMC7580831.