朱璐璐
广州紫馨整形外科医院
广州紫馨整形外科医院皮肤科主治医师
中国美容整形协会中医美容分会青年理事
广东省整形美容协会皮肤分会委员
CHO细胞表达系统与毕赤酵母表达系统是当前重组蛋白生产中发展前景较好的两个表达系统，为了能够更加直观地对两个表达系统有一定的认识，特意在此篇中对两个表达系统作一定的比较，从而能够更进一步的对两个表达系统有更深的了解。
CHO细胞表达系统
CHO细胞即中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary Cell)，是最具代表性的动物细胞表达系统，被广泛应用于生物制药领域。它建株于1957年，由美国科罗拉多大学Theodore T．Puck从一成年雌性中国仓鼠卵巢中分离得到，是一种连续细胞系，能传百代以上，具有永生性（不死性），是目前生物工程上广泛使用的细胞。
CHO细胞属于成纤维细胞（一种非分泌型细胞），既可以贴壁生长。也可以悬浮生长。目前常用的CHO细胞包括原始CHO和二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(DHFR-)突变株CHO。
由于CHO具有良好的基因组背景特征，并且在悬浮培养中具有相对较快的生长速度和较高的蛋白质表达产量，因此它被用作生物制品行业的主要生产用细胞系，是生产蛋白类生物制品最重要的表达系统。
1. CHO表达系统的优点
①具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；
②既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力；
③具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定；
④具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化；
⑤能以悬浮培养方式或在无血清培养中达到高密度培养。且培养体积能达到1000 L以上，可以大规模生产。
2. 存在的问题
①构建的重组CHO细胞生产效率低，产物浓度亦低；
②某些糖基化表达产物不稳定，不易纯化；
③重组CHO细胞上游构建与下游分离纯化脱节，主要表现在上游构建时着重考虑它的高效表达，而对高效表达的产物是否能有效地提取出来，即分离纯化过程考虑较少；
④重组细胞培养费用昂贵，自动化水平低下。
毕赤酵母细胞表达系统
自从1987年Cregg等首次用巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）作为宿主表达外源蛋白以来,作为一种新的高效的表达系统，毕赤酵母越来越引起人们的重视，到1995年，已有四十多种外源蛋白在该宿主菌中获得表达。而近年来报道的在毕赤酵母中表达的外源基因就有几十种，且一年比一年多。
1. 毕赤酵母表达系统的优点
①含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达；
②表达水平高，即可在胞内表达，又可分泌型表达。毕赤酵母中，报道的最高表达量为破伤风毒素C为12 g/L，一般大于1 g/L。绝大多数外源基因比在细菌、酿酒酵母、动物细胞中表达水平高。一般毕赤酵母中外源基因都带有指导分泌的信号肽序列，使表达的外源目的蛋白分泌到发酵液中，有利于分离纯化；
③发酵工艺成熟，易放大。已经有大规模工业化高密度生产的发酵工艺，且细胞干重达100 g/L以上，表达重组蛋白时，已成功放大到10000升；
④培养成本低，产物易分离。毕赤酵母所用发酵培养基十分廉价，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲醇，其余为无机盐，培养基中不含蛋白，有利于下游产品分离纯化；而酿酒酵母所用诱导物一般为价格较高的半乳糖；
⑤外源蛋白基因遗传稳定。一般外源蛋白基因整合到毕赤酵母染色体上，随染色体复制而复制，不易丢失；
⑥作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能。
2. 存在的问题
①分泌产物的不均一性，包括聚合体的存在，发酵周期较长，易污染，且长时间的发酵不利于外源蛋白的表达；
②不是一种食品微生物，且发酵时要添加甲醇，表达产物的卫生安全性需要考虑；
③分子生物学的研究基础差，要对其进行遗传学改造困难较大；
④分泌表达的蛋白在培养基中被自身分泌的蛋白酶降解，同时由于甲醇酵母多采用高密度发酵，蛋白酶也会随着细胞密度的增高而增高；
⑤有些蛋白在毕赤酵母中表达量很低或不表达，存在信号肽加工不完全，修饰功能欠完善以及内部降解等现象，给外源蛋白的纯化和工业化带来了困难，筛选药物价格昂贵也给生产应用带来局限。
CHO表达系统生产重组人源胶原蛋白的优势
虽然毕赤酵母表达系统具有与人体相近的蛋白修饰体，在胶原蛋白合成后经过修饰赋予折叠构象和特定氨基酸结构，成为具有生理活性的胶原。所得的重组胶原蛋白具有表达量高、更稳定、易纯化、不受内毒素影响生物活性高等优点，但生产周期长，表达量不宜控制，产生大量的糖基化高甘露糖，增加皮肤过敏的风险。
与毕赤酵母表达系统（真核细胞）相比，CHO表达系统（哺乳动物细跑）具有与人类相似的翻译后修饰能力，表达的蛋白与天然蛋白的结构、糖基化类型几乎相同，蛋白生物学活性更加接近天然蛋白。
此外，CHO表达系统还具有其他优势：清晰的历史背景和监管机构的认可，易于申报；很少分泌CHO内源蛋白；具有外源重组基因的高效扩增和表达能力；可悬浮培养或在无血清培养基中达到高密度培养，易于大规模生产，且有较高的耐受剪切力和渗透压等。
利用CHO表达系统生产重组人源胶原蛋白的技术已逐渐成熟，广州远想生物研究院通过技术创新，利用细胞工程技术敲除或播入一些糖基化相关的基因，有效调控聚糖结构的糖基化途径，减少胶原蛋白糖基化程度，在CHO表达系统上成功生产出重组100%人源化ⅩⅦ型胶原蛋白（伊肤泉小17），生物相容性高，安全不过敏，用于改善皮肤衰老等问题，已获国家药品监督管理局二类医疗器械认证。
参考文献
[1]Tihanyi B, Nyitray L. Recent advances in CHO cell line development for recombinant protein production[J]. Drug Discov Today Technol. 2020 Dec;38:25-34.
[2]Pan Y, Yang J, Wu J, Yang L, Fang H. Current advances of Pichia pastoris as cell factories for production of recombinant proteins[J]. Front Microbiol. 2022 Nov 24;13:1059777.
本文作者：白鹭
审阅、修订：海琅
未经授权，不得转载。
扫描二维码订阅
微针疗法公众号
便捷观看本期
和往期精彩内容
参与伊肤泉提供的产品活动
干货多多，福利多多
